Инфрапателларные жировые мезенхимальные стволовые клетки, или, короче говоря, IFP-MSC, являются относительно менее изученным типом стволовых клеток. Этот протокол является простым, надежным и воспроизводимым методом, демонстрирующим изоляцию IFP-MSC от козьего удушающего сустава. Основным преимуществом методики является то, что можно получить большое количество высококачественных IFP-МСК.
Изолированные IFP-МСК могут дифференцироваться в несколько линий и обладать обширным регенеративным потенциалом. Из-за своего анатомического расположения IFP-MSC заинтересовались восстановлением дефектов хряща и облегчением деградации хряща при остеоартрите. Метод имеет значение для клеточной терапии в области тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Процедуру выделения, расширения и дифференциации IFP-MSC продемонстрируют д-р Сугата Хазра и г-н Аман Махаджан. Чтобы начать выделение инфрапателлярных жировых мезенхимальных стволовых клеток, или IFP-MSC, соберите козьи бедренные суставы, охватывающие около 15 сантиметров бедренной и большеберцовой областей задних конечностей в стерилизованном ящике для отбора проб. Храните образец при четырех градусах Цельсия для транспортировки в лабораторию для дальнейшей обработки.
Поместите образец на 150-миллиметровую чашку Петри и обеспечьте асептическую обработку образца и шкаф биобезопасности на протяжении всей процедуры. Тщательно промойте его автоклавным PBS, дополненным антибиотиками. Держите образец гидратированным с помощью PBS.
Внимательно изучите анатомические области образца. Для легкого доступа удалите лишние ткани из обеих длинных костей полностью, удерживая торцевую поверхность бедренной кости одной рукой и разрезая ее продольно по направлению к суставу острыми ножницами. Затем, не нарушая ткани, окружающие суставную капсулу, удалите мышцы и жировую ткань из кости.
Аналогично сделайте еще один разрез на большеберцовом конце образца и удалите мышцы и жировую ткань из большеберцовой кости. Убедитесь, что обе длинные кости полностью обнажены и что суставная капсула видна. Затем сделайте разрез с обеих сторон синовиальной мембраны, чтобы разрезать сустав.
Отрежьте надколенник от синовиальной оболочки и надколенников с помощью свежих стерилизованных ножниц и щипцов. Немедленно поместите отделенную коленную чашечку в чашку Петри, содержащую PBS. Из отделенной надколенника удалите всю жировую подушку, присутствующую на внутренней поверхности, ножницами и щипцами.
Соберите его в другую свежую чашку Петри и измельчите с помощью скальпеля. Включите другие хирургические инструменты для получения небольших жировых сегментов около двух-трех миллиметров. Используйте шпатель, чтобы перенести измельченную ткань в 50-миллилитровую центрифужную трубку и трижды промыть ее PBS, дополненной антибиотиками, в течение 15 минут при комнатной температуре с помощью смесителя пробирки.
Для ферментативного пищеварения инкубируйте около пяти граммов измельченной ткани в модифицированной среде Dulbecco, или DMEM, среде с низким содержанием глюкозы, содержащей 1,5 миллиграмма на миллилитр коллагеназы типа II и 2% FBS при 37 градусах Цельсия в течение 12-16 часов. Осторожно аспирируйте переваренную ткань и фильтруйте ее через 70-микронный клеточный ситечко, чтобы удалить любую непереваренную часть. Центрифугируйте фильтрат в 15-миллилитровой центрифужной трубке в 150 раз г в течение пяти минут.
Удалите супернатант перед промывкой клеточной гранулы с низким содержанием глюкозы DMEM дважды. Повторно суспендируйте гранулы в полном DMEM, также известном как расширительная среда. Посейте клетки на 150-миллиметровую чашку Петри и культивируйте их в расширительной среде, дополненной пятью нанограммами на миллилитр основного фактора роста фибробластов, или BFGF, и 50 микрограммами на миллилитр 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты тринатриевой соли.
Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе 5% углекислого газа, чтобы позволить клеткам прилипать и размножаться. Ежедневно контролируйте прикрепление и рост клеток. Для надлежащего обслуживания и расширения IFP-MSC, меняйте носитель каждые три дня.
При смене среды добавьте свежие пять нанограммов на миллилитр BFGF и 50 мкг на миллиметр 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты тринатриевой соли непосредственно в чашку Петри. Как только клетки становятся сливающимися на 80-90%, субкультурируют их, удаляя расширительные среды из чашки Петри и промывая клетки 1X PBS. Затем добавьте в чашку четыре миллилитра 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом.
Через четыре минуты постучите по пластине на боку, чтобы выбить клетки. Подтвердите полное отсоединение всех клеток под микроскопом. После подтверждения добавьте равный объем расширительной среды, чтобы нейтрализовать трипсин.
Используйте пипетку, чтобы собрать эти диссоциированные клетки в свежую 15-миллилитровую полипропиленовую трубку и центрифугировать их в 150 раз в г в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в нужном объеме расширительной среды. Подсчитывают клетки с помощью стандартного метода подсчета клеток и субкультурируют их для дальнейшего расширения при плотности посева 10 000 клеток на квадратный сантиметр в 150-миллилитровой чашке Петри.
Для всех анализов используют сливающийся монослой клеток прохода с номерами от Р2 до Р5. Когда расширенные клетки достигнут 80-90% конфлюзии, диссоциируют клетки с помощью раствора Трипсина-ЭДТА, прежде чем гранулировать их вниз в 15-миллилитровой центрифужной трубке в 150 раз г в течение пяти минут. Затем повторно суспендируют гранулу в плазме козы при плотности 2 миллиона клеток на 50 микролитров. Добавьте 50 микролитров плазмы, содержащей клетки, на стерилизованную 90-миллиметровую чашку Петри с последующим добавлением хлорида кальция в конечной концентрации 0,3% Хорошо перемешайте для изготовления сшитого гидрогеля плазмы.
После инкубации изготовленного гидрогеля при 37 градусах Цельсия в течение 40 минут переложите гидрогели на 24-луночные пластины культуры тканей, содержащие хондрогенные среды. Меняйте медиа каждые три дня в течение 14 дней. Гидрогели, культивируемые в полной среде DMEM без TGF-beta 1, считаются неиндуцированными контрольными группами.
После 14 дней хондрогенной дифференцировки клеток в гидрогеле плазмы трижды промыть гидрогели PBS в течение пяти минут каждый, и зафиксировать образцы в нейтральном буферизованном формалине в течение трех часов. Изолированные IFP-МСК были гомогенно адгезивными и достигали удлиненной морфологии в течение 24 часов после культивирования in vitro. Клетки эффективно размножались от 80% до 90% слияния в течение шести дней после расширения и демонстрировали клоногенную способность, что указывает на эффективные пролиферативные и самообновляющиеся способности.
При лечении для дифференцировки в адипогенную линию изолированные клетки продуцировали липидные капли, что было подтверждено окрашиванием Oil Red O на 14 и 21 день. Такие капли масла не были видны в клетках без адипогенных индуцирующих факторов. Выделенные клетки, инкапсулированные в гидрогель плазмы, показали образование белой и глянцевой неоткани через 14 дней, в индуцированной группе проявился хондрогенный потенциал.
Неиндуцированная группа имела бледно-белую ткань с пониженной глянцевостью. Кроме того, положительное гистологическое окрашивание для Alcian Blue и Safranin O в индуцированной группе показало, что клетки могут секретировать сульфатированные гликозаминогликаны, один из основных компонентов хрящевой матрицы. Напротив, участки гидрогеля из неиндуцированных групп были отрицательными для окрашивания Сафранином О и Альциановым синим, подтверждая хондрогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стволовых клеток только в присутствии хондрогенных стимулов.
Изолированные клетки, индуцированные остеогенными средами, показали положительное окрашивание щелочной фосфатазы, подтверждая минерализацию в конце 14 дней. После 28 дней остеогенной индукции наблюдались кальцинированные отложения с окрашиванием Alizarin Red S. Результаты подчеркнули дифференцировочный потенциал индуцированных клеток в адипогенные, хондрогенные и остеогенные линии.
Важно обрабатывать образец в асептических условиях, чтобы избежать загрязнения. Также важно определить правильное расположение надколенника. Эта процедура открывает возможности для выделения различных типов клеток, таких как суставные хондроциты, фибробласты связок и стволовые клетки из синовиальной и синовиальной жидкости, имеющих широкое применение в регенеративной медицине.
После выделения IFP-МСК с использованием этого метода его эффективность была особенно исследована для регенерации костно-мышечных тканей, таких как хрящи, кости и связки, с использованием подходов без каркаса и каркаса.
