Этот протокол продемонстрирует реализацию и оптимизацию спектрально-фокусирующей SRS-микроскопии и то, как ее можно использовать для приложений рамановской гистологии в режиме реального времени. Основным преимуществом этого метода является скорость, с которой образцы могут быть обработаны после правильного выравнивания приборов, поскольку SRS не требует обработки тканей и окрашивания. Этот протокол применим к другим приложениям SRS, а не ограничивается только гистологией.
Такие приложения включают небольшие молекулы, лекарства, клетки и ткани. Начните с установки пары ахроматических линз для пучка накачки, чтобы увеличить размер лазерного луча в два раза в качестве отправной точки. Поместите объективы размером 100 и 200 миллиметров примерно на расстоянии 300 миллиметров друг от друга.
Затем выровняйте пучок насоса через центр обеих линз. Затем поместите зеркало после второй линзы, чтобы отправить луч к стене на расстоянии более одного метра. Проследите луч от зеркала до стены с помощью ИК-карты и проверьте, изменяется ли размер луча.
Коллимируйте луч, если луч изменяется в размере в зависимости от расстояния. Объедините два лазерных луча, установив дихроичное зеркало с несколькими зеркалами рулевого управления для регулировки. Оптимизируйте пространственное перекрытие насоса и Stokes, контролируя лучи после дихроичного зеркала в двух разных положениях на расстоянии около одного метра друг от друга.
Итеративно отрегулируйте рулевое зеркало, а затем дихроичное зеркало, чтобы выровнять балку Стокса с балкой насоса. Убедитесь, что комбинированные лучи направляются в центр сканирующих зеркал лазерного сканирующего микроскопа, регулируя пару зеркал рулевого управления, когда сканирующие зеркала находятся в припаркованном положении. После конденсатора используйте другую пару линз с фокусными расстояниями 100 миллиметров и 30 миллиметров соответственно, чтобы передать передаваемый луч на фотодиод, гарантируя, что оба луча содержатся внутри фотодиода.
Затем установите два фильтра нижних частот, чтобы заблокировать модулированный луч Стокса. Поместите пробоотборник луча в траекторию луча Стокса, чтобы забрать 10% луча и отправить его на быстрый фотодиод для обнаружения импульсного поезда 80 мегагерц. Возьмите один из выходов буфера вентилятора и отфильтруйте его с помощью полосового фильтра, чтобы получить синусоидальную волну 20 мегагерц.
Затем используйте радиочастотный аттенюатор, чтобы отрегулировать выходной пик к пиковому напряжению примерно до 500 милливольт. Отправьте полученный выход на фазовращатель, который позволяет точно регулировать радиочастотную фазу с источником напряжения. Отправьте этот выход на радиочастотный усилитель мощности и подключите выход усилителя к EOM.
После разблокировки луча Стокса оптимизируйте глубину модуляции первого EOM, разместив фотодиод на пути луча. Отрегулируйте напряжение EOM и четвертьволновую пластину до тех пор, пока глубина модуляции не станет удовлетворительной. Поместите фотодиод после дихроичного зеркала, чтобы обнаружить лазерный луч.
Сначала заблокируйте луч Стокса, а затем увеличьте масштаб одного из пиков импульса насоса на осциллографе. Поместите вертикальный курсор, чтобы отметить временное положение этого пика с помощью осциллографа. Теперь заблокируйте пучку насоса и разблокируйте балку Стокса.
Переведите этап задержки, чтобы временно сопоставить пиковые позиции на осциллографе с отмеченным положением на предыдущем шаге. Путем расчета расстояния задержки, необходимого для соответствия двух лучей, с последующим удлинением траектории луча более быстрого луча или сокращением траектории луча более медленного луча. Затем подготовьте образец слайда микроскопа с DMSO и двусторонней лентой в качестве распорки для удержания образца между слайдом и крышкой.
Поместите образец на микроскоп стороной крышки, обращенной к объективу микроскопа, и наблюдайте за образцом из I-образной части при ярком освещении. Найдите фокус образца как в верхнем, так и в нижнем слое пузырьков воздуха на интерфейсе стеклянной ленты, а затем переместите фокус, чтобы он находился между двумя слоями ленты. Затем установите перестраиваемый выход луча на 798 нанометров.
Исходя из оптической пропускной способности конденсатора, отрегулируйте оптическую мощность примерно на 40 милливатт каждый для насоса и пучков Стокса в фокусе цели. Затем откройте сканированное изображение в MATLAB и нажмите на кнопку с надписью фокус, чтобы начать сканирование. Отрегулируйте рулевое зеркало перед сканером galvo, чтобы центрировать сигнал постоянного тока на дисплее первого канала.
Переместите моторизованный каскад задержки и внимательно наблюдайте за выходом блокировки, отображаемым на дисплее второго канала. Наконец, отрегулируйте временную задержку, чтобы максимизировать интенсивность сигнала переменного тока. Отрегулируйте дихроичное зеркало, чтобы центрировать сигнал SRS на канале переменного тока.
Затем отрегулируйте фазу блокирующего усилителя, чтобы максимизировать сигнал. После установки образца слайд на микроскоп и регулировки мощности обоих пучков примерно до 40 милливатт каждый в фокусе образца, как показано ранее. Откройте сканированное изображение из MATLAB.
Затем найдите максимальный сигнал SRS, просканировав через стадию задержки, соответствующую 2, 913 обратно-сантиметровому рамановскому пику DMSO. Получите изображение SRS, соответствующее рамановскому пику DMSO длиной 2 913 обратных сантиметров. Откройте изображение в ImageJ и выделите небольшую область в центре кадра.
Используйте функцию меры для вычисления среднего и стандартного отклонения значений в выбранной области. Для калибровки частотного доступа сохраните гиперспектральное сканирование с диапазоном стадий задержки, охватывающим 2, 913 и 2, 994 обратных сантиметровых рамановских пиков ДМСО. Затем сохраните позиции сцены, соответствующие набору гиперспектральных данных.
Выполните линейную регрессию для положений ступени и рамановские сдвиги на 2, 913 и 2, 994 обратных сантиметра. Используя уравнение линейной регрессии, преобразуйте позиции задержки в соответствующие рамановские частоты. Для калибровки спектрального разрешения оцените положение ступени на основе предыдущего положения с увеличенной длиной оптического пути за счет вставки стержней.
Перестроить балки пространственным перекрытием из-за небольшого отклонения балки при добавлении стеклянных стержней. Установите поляризационный светоделитель пучка, четвертьволновую пластину и вторую EOM в траекторию пропитывающего луча после первого EOM. Отключите вход сигнала ко второму EOM, затем подключите сигнальный вход к первому EOM и включите его.
Модулируйте луч Стокса на 20 мегагерц, отправив луч через первый EOM. Отрегулируйте наклон и положение первого EOM, чтобы убедиться, что луч центрирован через кристалл EOM. Подготовьте образец тканевого слайда с помощью двусторонней ленты, слайда микроскопа и покровного стекла.
Поместите образец на микроскоп стороной крышки, обращенной к объективу микроскопа. Для эпимодальной визуализации SRS установите полуволновую пластину перед тем, как луч войдет в микроскоп, чтобы изменить поляризацию пучка, идущего в микроскоп. Поместите поляризационный разветвитель пучка над объективом, чтобы деполяризованный обратно отраженный луч достиг детектора.
Затем используйте 75-миллиметровую ахроматную линзу и 30-миллиметровую асферическую линзу для ретрансляции задних рассеянных фотонов от задней диафрагмы объектива к фотодетектору. Установите детектор для сбора обратного рассеянного света, направленного поляризационным делителем пучка. Затем установите фильтр, чтобы заблокировать попадание модулированного луча в детектор.
Изменение длины стержня влияет на спектральное разрешение. Когда не используются стеклянные щебечущие стержни, два рамановских пика от DMSO вообще не разрешаются. Увеличение количества стеклянных щебечущих стержней начинает разрешать два пика в удовлетворительной точке.
Согласованное щебетание разрешает оба пика и может использоваться для калибровки положений ступеней по частоте. Две замедленные импульсные цепи ортогональной поляризации, используемые для изображения спектров DMSO, показывают временную задержку между возбуждениями SRS с приемлемой глубиной модуляции и временным разделением. Напротив, плохой двухцветный фазовый сдвиг SRS, порождает перевернутые или отрицательные пики.
Здесь показаны двухцветные изображения SRS в режиме реального времени на 2, 850 и 2, 930 обратных сантиметрах ткани мозга мыши ex vivo. Необработанные липидные и белковые изображения были окрашены в цвет, чтобы получить одно изображение, изображающее вклад липидов и белков. Ложное перекрашивание гематоксилина и эозина также проводилось для имитации окрашивания гематоксилина и эозина для патологических применений.
Пространственно-временное перекрытие и оптимизация пространственного разрешения являются наиболее важными шагами для подхода пространственной фокусировки SRS. Этот метод обычно применим для других экспериментов по микроскопии насосного зонда, таких как переходно-абсорбционная микроскопия. Метод также позволяет визуализировать нефлуоресцентные молекулы в клетках и тканях.
Представленный здесь метод ускоряет время получения изображения для будущей трансляции стимулированной рамановской гистологии в клинике.
