В большинстве случаев обычный сайт-направленный мутагенез не подходит для изучения функциональной роли пролинов в белках. Здесь мы представляем метод включения аналогов пролина в качестве неканонических аминокислот в рибосомно-синтезированные белки для исследования роли остатков пролина в сворачивании и функции белка. Замена пролинов стандартными аминокислотами является рискованным подходом.
Включение аналогов пролина позволяет провести своего рода молекулярную хирургию. Другими словами, он вводит тонкие молекулярные изменения, чтобы рационально влиять и манипулировать свойствами белка. Поскольку остатки пролина играют важную роль в стабильности белковых каркасов, наша технология может быть полезна для понимания причин дефицита сворачивания белка, который лежит в основе определенных патологических состояний у людей.
Изменения белка, индуцированные заменителями пролина, имеют значение для биотехнологической инженерии ферментов и предоставляют возможности для усиления трансляции или сворачивания рибосомного белка. Этот способ не требует специального оборудования и дорогостоящей аппаратуры. Особую осторожность следует соблюдать с протокольными этапами, при которых нативный пролин истощается из культур E.coli до добавления аналогов пролина.
Чтобы начать производство флуоресцентных белков с нативным пролином, инокулируют 200 миллилитров свежей среды NMM в двухлитровую колбу Эрленмейера двумя миллилитрами ночной культуры. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в орбитальном шейкере при 220 об/мин в течение примерно 3,5 часов. Во время инкубации измеряйте оптическую плотность на 600 нанометрах в спектрофотометре каждые 30 минут.
Когда оптическая плотность достигнет 0,7, раскрутите суспензию ячейки и осторожно декантируйте супернатант в отходы. Затем промывайте клетки, повторно используя в 50 миллилитрах ледяного NMM без каких-либо аминокислот или NMM без пролина. Снова раскрутите клетки и превратите супернатант в отходы.
Затем повторно суспендируют клеточную гранулу путем мягкой пипетки в 200 миллилитрах НММ без пролина и дополняют ампициллином в двухлитровой колбе Эрленмейера и инкубируют клетки в орбитальном шейкере в течение 30 минут, чтобы обеспечить полное истощение пролина. После инкубации добавляют соответствующий объем либо L-пролина, либо аналогов пролина из 50-миллимолярных стоковых растворов для получения одномиллимолярной конечной концентрации в клеточной суспензии. Затем индуцируйте экспрессию целевого белка путем добавления 500-микромолярного IPTG из одномолярного раствора.
Экспрессируйте целевой белок в течение ночи при 37 градусах Цельсия в орбитальном шейкере и измерьте оптическую плотность на следующий день. Соберите бактериальные клетки путем центрифугирования и декантируйте супернатант в отходы. Затем промыть клетки путем тщательного пипетирования в 50 миллилитрах связывающего буфера, содержащего 10% глицерина.
Снова раскрутите ячейки, декантируйте супернатант и храните гранулу ячейки в 50-миллилитровой трубке при минус 20 или 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Перед оценкой флуоресцентного излучения выполните SDS-PAGE, чтобы убедиться, что чистота образца выше 95%Затем отрегулируйте образцы каждого очищенного варианта белка до концентрации 0,3 микромоли, взяв рассчитанное значение поглощения на соответствующей длине волны в качестве эталона. Убедитесь, что приблизительный конечный объем образца составляет 200 микролитров.
Пусть разбавленные образцы уравновешиваются при комнатной температуре. Через час перенесите образцы в односантиметровую кварцевую кювету и измерьте спектр флуоресцентного излучения образцов с помощью флуоресцентного спектрометра. Чтобы индуцировать денатурацию, разбавьте образцы каждого варианта белка в двадцать раз, добавив два микролитра 300-микромолярных образцов к 18 микролитрам буфера 1,11X PBS, содержащего 8,89-молярной мочевины и 5,56-миллимолярного DTT.
Инкубируйте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем разбавьте образцы в 100 раз, добавив 1 980 микролитров PBS, содержащих пятимимолярный DTT, чтобы вызвать ренатурацию и немедленно перенесите 200 микролитров образцов в односантиметровую кварцевую кювету. Вставьте кварцевую кювету в соответствующий флуоресцентный спектрометр и контролируйте повторное сворачивание белка, приобретая спектр флуоресценции каждые три секунды в течение 30 минут.
Перенесите повторно складывающиеся образцы в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки, затем закройте крышку и храните образцы при комнатной температуре в темноте, чтобы обеспечить полное повторное складывание вариантов EGFP. Через 24 часа измерьте флуоресцентное излучение восстановленных образцов белка, используя ту же длину волны возбуждения, что и раньше, чтобы захватить временную конечную точку восстановления флуоресценции. Гранулы из клеток, экспрессирующих нативный белок и варианты, несущие S-фторпролин и дегидропролин, имели типичный яркий цвет благодаря интактному хромофору.
Напротив, варианты, содержащие R-фторпролин и дифторпролин, оставались бесцветными, что указывает на неправильное сворачивание и осаждение развернутого белка в телах включения. Анализ SDS-PAGE подтвердил наличие нерастворимых R-фторпролинсодержащих белков. Напротив, в растворимых фракциях были обнаружены нативные белки и S-фторпролиновые и дегидропролинсодержащие варианты.
В анализе жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии каждая замена пролина S-фторпролином производила положительный сдвиг 18-дальтон на остаток пролина, в то время как замена дегидропролином приводила к отрицательному сдвигу в два дальтона на остаток. В спектрах поглощения света и излучения поглощение хромофора было обнаружено на уровне 488 нанометров для EGFP и 493 нанометров для NowGFP. В KillerOrange область поглощения хромофора состояла из двух полос, соответствующих двум возможным конфигурационным и зарядовым состояниям комплексного хромофора.
Кроме того, флуоресцентные спектры, регистрируемые при возбуждении на соответствующих максимальных длинах волн поглощения, подразумевали, что аналоги не изменяют химическую среду хромофоров. В экспериментах по рефолдированию нативная флуоресценция хромофора EGFP частично восстановилась, хотя триптофан-специфическая флуоресценция была больше после ренатурации. Аналогичное поведение наблюдалось для варианта, содержащего дегидропролин.
У EGFP-содержащего S-фторпролина аналогичный результат наблюдался при 295-нанометровом возбуждении, в то время как флуоресценция восстанавливалась в гораздо большей степени при 488 нанометрах. Только варианты EGFP показали быструю кинетику повторного складывания, при этом восстановление эмиссии триптофана было в два раза быстрее по сравнению с эмиссией хромофора. Необходимо использовать свежие бактериальные культуры с подходящими питательными средами.
Стерильные методики и регулярный мониторинг роста культуры также являются важными предпосылками успеха эксперимента. Этот метод применим к белковой инженерии, так как позволяет изучать роль других канонических аминокислот. Для этого нужны подходящие ауксотрофные штаммы E.coli и аминокислотные аналоги.
Масс-спектрометрия цельных белков требуется в качестве аналитического доказательства для подтверждения включения неканонических аналогов аминокислот. Метод SPI для включения аналогов пролина позволяет нам напрямую манипулировать белковой основой и предлагает преимущества для рационального проектирования и облегчения производства белков за счет глобальной стабилизации и улучшения рибосомной трансляции или сворачивания.
