Наш протокол описывает проектирование, сборку и валидацию диагностики на основе генных схем. Эти бумажные молекулярные диагностики являются недорогими и чувствительными, способными обнаруживать клинически значимые концентрации нуклеиновых кислот и могут быть разработаны для обнаружения практически любой последовательности. Это технология платформы, которая может быть разработана пользователями для их нужд и имеет потенциал для переноса диагностики клинического уровня в более децентрализованные стоматологические ресурсы.
Бесклеточный датчик переключения может быть разработан практически для любой мишени на основе нуклеиновых кислот. Недавняя работа продемонстрировала бесклеточную диагностику Эболы, норовируса, SARS-CoV-2, C.difficile и бактерий, вызывающих брюшной тиф. Продемонстрировать процедуру будут Северино Джефферсон Риверо да Силва, постдокторант, и Пурия Баят, аспирант из моей лаборатории.
Чтобы спроектировать переключатель, определите целевые последовательности из генома вируса Зика и выберите целевые последовательности вируса Зика из ампликонов, как описано в текстовом протоколе. Загрузите пакет программного обеспечения для проектирования коммутаторов toehold. Откройте MATLAB и перейдите в папку программного обеспечения для проектирования.
Введите целевые последовательности в csv-файл входного файла проекта, расположенный во входной вложенной папке. Выберите параметры, которые будут использоваться для функции проектирования. Запустите функцию проектирования, чтобы создать дизайн переключателя toehold для интересующих целей.
По завершении перейдите в папку final_designs и найдите последовательности проектирования переключателя верхнего носок и соответствующие целевые последовательности в электронных таблицах формата csv. Убедитесь, что последовательности ДНК переключателя пальцев ног, генерируемые алгоритмом, содержат промоторные последовательности T7 на пяти простых концах и законсервированную последовательность 21 нуклеотидного линкера на трех простых концах. Используйте NCBI BLAST для проверки последовательностей проектирования переключателей верхнего носка от других распространенных вирусов, проверяя гомологию последовательностей.
Принимайте последовательности с гемологией менее 40%. Готовят растворы носкового переключателя шпильки ДНК олиго и праймеров обратной амплификации в концентрации 10 микромоляров в безнуклеазной воде. Соберите реакции в ПЦР-трубках на льду согласно этой таблице.
Поместите реакционные трубки в термоциклер, следуя условиям циклирования, перечисленным в этой таблице. Анализ препаратов ПЦР на агарозном геле. Очищают продукты ПЦР и элюируют ДНК в минимальном объеме безнуклеазной воды для обеспечения достаточно высокой концентрации.
Количественно оцените ДНК с помощью спектрофотометра. Приготовьте раствор CPRG, растворив 25 миллиграммов порошка в одном миллилитре воды без нуклеазы. Приготовьте мастер-микс на льду в соответствии со стандартным протоколом, показанным здесь.
Дозируйте бесклеточную мастер-смесь в пробирки ПЦР. Для бесклеточных элементов управления и управления только переключением добавьте воду без нуклеазы до объема 5,94 микролитров. А для реакции добавьте ПЦР очищенную ДНК переключателя пальцев ног, чтобы получить конечную концентрацию 33 наномоляра.
Чтобы проверить переключатель пальца ноги и комбинацию целевой РНК, добавьте транскрибированную in vitro целевую РНК к конечной концентрации одного микромоляра. Тщательно перемешайте все реакции путем пипетирования и центрифуги. На черной прозрачной нижней плите из 384 скважин добавьте 30 микролитров воды без нуклеаз в скважины, окружающие реакционные скважины.
Затем, используя двухмиллиметровый биопсийный перфоратор и пинцет, вырежьте заблокированные BSA диски фильтровальной бумаги и поместите их в реакционные колодцы. Распределите 1,8 микролитра из каждой реакционной трубки на диски фильтровальной бумаги в 384-луночной пластине в трех экземплярах. Накройте пластину прозрачной ПЦР-пленкой и поместите ее в считыватель пластин.
Измеряйте поглощение на 570 нанометров при 37 градусах Цельсия каждую минуту в течение 130 минут. Приготовьте 25 микромолярный раствор всех наборов прямых и обратных праймеров в воде без нуклеаз. Настройте реакцию в пять микролитров, используя мастер-микс, показанный здесь.
Перемешайте путем пипетирования до тех пор, пока белый осадок не солюбилизируется, а затем дозируйте в пробирки для ПЦР. Добавьте прямую и обратную праймеры в соответствующие трубки, а затем добавьте один микролитр либо воды без нуклеазы, либо два пикомоляра целевой триггерной РНК. Перемешайте путем мягкой пипетки и ненадолго раскрутите трубки.
Настройте протокол инкубации на термоциклере, как показано здесь. Через 12 минут удалите трубки и добавьте 1,25 микролитра ферментной смеси в каждую трубку с последующим смешиванием и центрифугированием. Верните трубки в термоциклер после пропуска шага удержания 41 градуса Цельсия, чтобы начать одночасовую реакционную инкубацию.
Затем, чтобы оценить производительность грунтовки, соберите реакции безячеистого переключателя на бумажной основе и проанализируйте данные. Для анализа чувствительности определите пары праймеров-кандидатов и подготовьте серийные разведения целевой РНК в воде без нуклеаз. Повторите NASBA и бесклеточные реакции с выбранными наборами праймеров в биологических трипликатах.
Используя один микролитр экстрагированной РНК пациента, выполните амплификацию NASBA и бумажные бесклеточные реакции, как показано в пятом разделе. После реакций подготовьте реакционную пластину с 384 лунками и проведите анализ в портативном считывателе пластин при 37 градусах Цельсия. Затем соберите компоненты RT-qPCR и добавьте реагенты в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку в соответствии с этой таблицей.
Перемешайте реакцию путем пипетирования. Дозируйте 6,5 микролитров в каждую лунку 96-луночной или 384-луночной ПЦР-пластины, а затем 3,5 микролитра каждого шаблона РНК в трех экземплярах. Поместите пленку ПЦР поверх пластины.
Центрифугируйте пластину из 384 скважин при 600 G в течение двух минут. Поместите пластину в машину RT-qPCR и выполните условия цикла, как показано здесь. Следуя вычислительному проекту, три переключателя были построены и проанализированы с использованием электрофореза агарозного геля.
Полоса около 3000 пар оснований указывала на успешную реакцию. Переключатели пальцев ног оценивались по их соответствующей транскрибированной in vitro триггерной РНК. В то время как все три датчика демонстрировали увеличение поглощения, датчик 27B имел наиболее быструю скорость, тогда как переключатели 33B и 47B имели более низкое соотношение включения / выключения, указывающее на фоновую активность и снижение специфичности.
Сменное изменение поглощения на 570 нанометров показало, что переключатель 27B обладает лучшей производительностью с соотношением включения/выключения сигнала. Кроме того, в сочетании с NASBA он может обнаруживать РНК в концентрациях до 124 молекул на микролитр, что указывает на высокую чувствительность. Образцы пациентов с вирусом Зика из Бразилии были протестированы для оценки клинической диагностической точности датчиков с использованием портативного считывателя пластин.
Изменение цвета с желтого на фиолетовый выявило положительный образец. Колориметрический отклик для каждой реакции на бумажной основе был построен с течением времени встроенным программным обеспечением на портативном считывателе пластин PLUM. Образцы, превысившие порог, были признаны положительными.
Клиническая эффективность датчика была установлена путем сравнения с RT-qPCR. Образцы считались положительными, когда пороговое значение цикла было равно или меньше 38. Важно убедиться, что результаты экранов переключения пальцев ног и чувствительности грунтовки NASBA воспроизводимы и оптимизированы, прежде чем переходить к испытаниям пациентов.
Учитывая свою простоту и адаптивность, диагностическая платформа, описанная здесь, проложила путь для разработки новых инструментов для оказания медицинской помощи, которые могут принести пользу системе здравоохранения, особенно для стран с низким уровнем дохода.
