Этот протокол может помочь тем, кто участвует в сообществе арбузов, оценить патоген фузариозного увядания, и это поможет определить популяции патогенов, которые присутствуют, и поможет эффективно управлять им. Фузариозное увядание при расовом типировании является сложным и трудоемким для завершения, и наличие трех жизнеспособных вариантов биоанализа расового типирования позволит пользователям выбрать метод, наиболее подходящий для их экспериментальных условий. Все три метода помогают практикующим врачам диагностировать потенциальную тяжесть инфекций фузариозного увядания, связанных с конкретным изолятом.
Эта информация позволяет принимать обоснованные и эффективные комплексные решения по борьбе с болезнями. Чтобы начать подготовку к посадке, заполните стартовые плоскости ячейки 8x16 посадочной средой, одновременно постукивая вниз для сжатия почвы. Затем посейте семена с их вершиной, направленной вверх на глубину, равную их длине.
После того, как семена посеяны, накройте среду, содержащую захороненные семена, землей Фуллера на глубину от 0,3175 до 0,635 сантиметра, а затем запотейте равнины, чтобы смочить среду, не создавая стоячей или сливающейся воды. После этого держите среднее влажное, запотевая в течение 20 секунд каждые 180 минут в течение пяти дней до прорастания семян. После прорастания поливайте квартиры один раз в день.
Через пять дней после посадки поместите инфильтрированные бумажные диски диаметром от 1 до 1,25 сантиметра, содержащие предпочтительный изолят фузариоза оксиспорума, на одну осветленную среду сока V8 и агар декстрозы картофеля силой 1/4 или пластину среды QPDA, чтобы хранить их в инкубаторе при температуре 28 градусов Цельсия в течение восьми дней. На восьмой день перенесите пластины V8 и QPDA в шкаф биобезопасности перед смещением конидий путем соскабливания распределителя стерильных клеток по поверхности среды и объедините суспензию жидкой конидии в стерильную 50-миллилитровую культуральную трубку. Затем количественно оцените количество спор и подготовьте окончательный раствор инокулята, перенеся расчетный объем около 1 миллиона спор в свежую стерильную культуральную трубку и доведя общий объем до 30 миллилитров со стерильной деионизированной водой.
Чтобы подготовиться к прививке, поместите 6x12 клеток пенопласта, предварительно продезинфицированных 10% отбеливателем и хорошо промытых для получения привитых растений. За несколько часов до прививки тщательно поливайте растения. Через два часа после полива удалите растения из плоских клеток пенополистирола 8x16 и промойте их корни.
Затем временно храните промытые растения в чистых контейнерах с водопроводной водой до использования, сохраняя сорта отдельно друг от друга. Позже разделите растения на группы по шесть особей и держите группы саженцев завернутыми во влажные бумажные полотенца на лабораторном лотке. Поместите от 25 до 30 кубических сантиметров почвы в нижнюю часть каждой ячейки лотка из пенополистирола 6x12 и используйте бутылку для брызг, чтобы намочить почву, пока она не станет заметно влажной.
Начиная со здорового контроля, поместите группу неповрежденных шести саженцев того же сорта в 50-миллилитровые трубки, содержащие инокулятор. Для прививки вихрь трубки сеялок с корнями погружены в воду на 30 секунд. Затем поместите одну сеялку на ячейку в пенопласт 6x12 с растениями того же сорта в одну колонну лотка.
Залейте сателлитки посадочной средой и аккуратно сложите. Используйте шприц, чтобы смочить растение 20 миллилитрами воды, избегая брызг. Когда все растения будут пересажены, поместите растения на ночь в закрытую темную среду со средней температурой 27 градусов по Цельсию.
Чтобы заразить ядра, приготовьте инокулят, выделив и культивируя штамм fusarium oxysporum niveum на пластине QPDA до такой степени, что его рост покрывает половину пластины. Подготовьте ядра, добавив стерильную водопроводную воду в литровые стеклянные колбы Эрленмейера, содержащие 200 граммов ядер, чтобы полностью покрыть зерна до не менее пяти сантиметров. После замачивания ядер в колбах при температуре 24 градуса Цельсия в течение двух часов слейте воду из колбы и заткните отверстие колбы куском ватного рулета, завернутым в сырную ткань, прежде чем покрыть отверстие оболочкой из алюминиевой фольги.
Стерилизуйте колбы в автоклаве на гравитационном цикле в течение одного часа с пятиминутным временем высыхания, затем дайте колбам остыть до комнатной температуры. Переложите зерна в грибной мешок с фильтром. Извлеките воздух из пакета, а затем сложите лишний пластик вокруг него.
Поместите пакет в пластиковый автоклавно-безопасный бункер и накройте контейнер алюминиевой фольгой, затем снова автоклав, используя те же настройки, что и раньше. После автоклавирования дайте грибку высиживаться на ядрах в пакете в течение трех недель. Используйте стерильное пробковое отверстие размером номер четыре, чтобы вырезать диски агара диаметром шесть миллиметров из зоны активного роста на культуральной пластине.
Разверните мешок, чтобы поместить пять агаровых дисков со строгой стерильной техникой. Используйте стерильный 50-миллилитровый градуированный цилиндр для измерения и добавления 35 миллилитров стерильной водопроводной воды в пакет. Наполните пластиковый горшок горшечной смесью, а затем добавьте измеренное количество горшечной смеси в большой пластиковый пакет, содержащий 14 зерен зараженных ядер.
Создайте воздушную подушку в пакете и запечатайте его закрытым перед смешиванием ядер и почвы, перевернув пакет несколько раз. После этого заполните поверхностно-стерилизованный горшок зараженной почвенной смесью. Повторите процесс для каждого оставшегося сорта арбуза, в общей сложности четыре полных горшка зараженной почвы на изолят, который тестируется.
Затем посейте шесть семян арбуза в горшок верхним концом семени, обращенным вверх. Используя баллончик с распылителем, смочите верхние 0,3-0,6 сантиметра почвы водой, а затем поместите прозрачную пластиковую посуду под и над каждым горшком. Залейте 48 ячеек вставками паропастеризованным песком, торфом, вермикулитом в соотношении 4:1:1 и постучите по вставкам для сжатия почвы.
Затем поместите вставки в пластиковые лотки и посейте семена, как объяснялось ранее. За семь дней до посадки привите пять пластин QPDA инфильтрированной бумагой, чтобы хранить их в инкубированной зоне в течение восьми дней в темном цикле 14 часов / 10 часов. На седьмой день переложите две свечи агара площадью один квадратный сантиметр в каждую 250-миллилитровую колбу Эрленмейера, содержащую 100 миллилитров картофельной декстрозы, и поместите колбы Эрленмейера на настольный шейкер.
В день прививки собирайте споры, фильтруя инокулятор через четыре слоя стерильной сырной ткани, чтобы определить микроконидиальную концентрацию колбы. Через 14 дней после посева переложите клеточные вставки с рассадой в перепончатый лоток, затем поместите перепончатый лоток с рассадой в пластиковую ванну, содержащую семь литров суспензии инокулята. После 15 минут хранения инокулята нетронутым, переместите клеточные вставки, содержащие привитые саженцы, в лотки без отверстий и поместите лотки без отверстий на скамейку теплицы с последующим поливом по мере необходимости.
Поддерживайте освещение и условия окружающей среды, как описано ранее для биоанализа корневого погружения. В зависимости от используемого метода, начните рейтинг, наблюдая и рассчитывая частоту увядания и гибели растений, и делайте цифровые изображения для документирования прогресса заболевания. В модифицированном методе погружения в лоток сорта Black Diamond и Charleston Gray, зараженные изолятом расы-2, показали серьезные симптомы и умерли.
Напротив, сорт Citrullus amarus PI показал устойчивость. В методе корневого погружения саженцы, инфицированные изолятом расы-0, в основном выживали, в то время как почти все саженцы, инфицированные изолятом расы-3, умирали. В методе заражения ядрами сорта Sugar Baby и Charleston Gray, выращенные в зараженной расой 2 почве, начали увядать и умирать, в то время как растения Citrullus amarus PI все еще кажутся здоровыми.
Не забывайте сеять и поддерживать растения соответствующим образом, проверять изолят патогена на жизнеспособность, понимать уникальные методы каждого метода вакцинации и быть последовательным при оценке симптомов заболевания. С помощью результатов этих методов исследователи могут исследовать лежащие в основе генетические детерминанты, управляющие дифференциальной дисперсией экспрессии между изолятами посредством секвенирования и сравнительного геномного анализа. Используя эти методы, исследователи смогли оценить распространенность различных фенотипов вирулентности в разных местах и сравнить эти фенотипы с наблюдаемыми генетическими элементами.
