Здесь мы предоставляем рабочий процесс, который включает в себя лучший метод биоинформатики для проведения экспериментов по оценке влияния глифосата на микробиомы. Основным преимуществом является то, что он обеспечивает надежную проверяемую гипотезу для будущих полевых и лабораторных экспериментов. Описанная методология может быть применена к различным системам, включая растения, животных и микробы.
Каждая часть методологии довольно проста. Возможно, самой сложной частью является интеграция многопрофильной команды, способной выполнять различные части работы. Продемонстрировать процедуру будет Суни Мэтью, исследователь из моей лаборатории.
Для начала начать эксперимент один, разделив экспериментальное поле на 10 реплик контроля и обработки GBP буферными полосами растительности между участками. Обработайте контрольные участки водопроводной водой, а участки GBP коммерческим GBP, чтобы имитировать максимально допустимую дозировку глифосата в сельскохозяйственной практике. Возьмите пробу микробиоты из экспериментальных растений.
Соберите 10 реплик образцов растений с поля, сразу же поместите их на лед и доставьте в лабораторию для дальнейшей обработки. Для второго эксперимента соберите подстилку, включая древесную стружку, фекалии и некоторые пролитые корма от перепелов, питающихся загрязненными GBP, или контрольные корма в 12-месячном вольерном эксперименте. Отправьте образцы постельного слоя в аккредитованную лабораторию для измерения концентрации глифосата непосредственно после его распространения.
Посадите многолетние травы и клубничные растения на каждом участке, чтобы изучить их корневую и листовую микробиоту. Идентификация и удаление эндофитных микробов путем промывки и стерилизации образцов растений. После того, как образцы стерилизованы, извлеките геномную ДНК с помощью коммерчески доступного набора для экстракции ДНК растений в соответствии с протоколом производителя.
Используя вложенный подход, амплируйте переменные области от V6 до V8 гена 16S рРНК и составляйте мастер-микс ПЦР для необходимого количества образцов, как описано в текстовой рукописи. Для первого раунда ПЦР используют праймеры 799 вперед и 1492 реверс. Настройте профиль усиления в термоциклере на 35 циклов.
Для проверки амплификации проводят электрофорез с использованием пяти микролитров амплифицированного продукта, а затем разбавляют остальные 25 микролитров продукта ПЦР в автоклавной сверхчистой воде в соотношении один к 10. Используя универсальные праймеры 1062 вперед и 1390 реверс, проводят второй раунд усиления с 25 тактами. Полученные продукты ПЦР разводят в автоклавной сверхчистой воде в равном соотношении.
Выполните третий раунд усиления с восемью циклами, чтобы пометить продукты штрих-кодами и последовательностью адаптеров P1. Проверить концентрацию в качестве продуктов ПЦР на биоанализаторе и объединить объемы, составляющие 30 нанограммов ДНК каждого образца в 1,5-миллилитровой пробирке для подготовки эквимолярной библиотеки. Выберите ампликоны размером от 350 до 550 пар оснований путем фракционирования размеров с помощью автоматизированной системы выбора размера ДНК на кассете с агарозным гелем.
Соберите элют, содержащий ампликоны указанного размера, во флакон в кассете, в результате чего будет получена очищенная библиотека генов 16S рРНК. Переложите собранный элюент в 1,5-миллилитровую трубку и проверьте чистоту и концентрацию на биоанализаторе. Разбавьте библиотеку ДНК с помощью автоклавной сверхчистой воды до конечной концентрации 26 пикомоляров.
Чтобы усилить область ИТС, после настройки реакции с праймерами ИТС устанавливают профиль усиления на термоциклере. Затем анализируют пять микролитров усиленного продукта на 1,5% агарозном геле и разбавляют оставшиеся 25 микролитров продукта в соотношении один к 10 с помощью автоклавной сверхчистой воды. Сделайте мастер-микс ПЦР для необходимого количества образцов с помощью фармер со штрих-кодом и обратных грунтовок с тегами адаптера P1.
Используя разбавленный продукт ПЦР в качестве шаблона, проводят второй раунд амплификации. Подобно подготовке библиотеки для гена 16S рРНК, подготовьте библиотеку для очищенной области ITS. Инициировать биоинформатический анализ последовательности белка EPSPS.
Оцените потенциальную чувствительность последовательности запросов к глифосату с предоставленных сервером выходов, где на выходе показана доля аминокислотных маркеров, присутствующих в последовательностях запросов, и количество мотивов. Второй вывод показывает выравнивание последовательностей запросов и ссылок на основе остатков маркеров. Третий вывод показывает полное попарное выравнивание последовательностей запроса и ссылок.
На четвертом выходе показаны эталонные последовательности EPSPS Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis и Streptomyces davawensis. В конце выходной страницы найдите ссылки на внешние инструменты, такие как BLASTp и сохраненные домены, для дальнейшего анализа последовательности запросов EPSPS. После идентификации последовательностей EPSPS из общедоступных репозиториев получите доступ к этим наборам данных с главной страницы сервера класса EPSPS, содержащей таксономическую информацию и класс EPSPS из более чем 50 000 последовательностей.
Взвесьте наземную биомассу растений в конце полевого сезона, чтобы сравнить рост растений на GBP и контрольных участках. В электронной таблице отобразите бактериальные ОТУ для экспериментов с микробиомом в предварительно вычисленные наборы данных. И на основе вероятностной оценки рассчитайте внутреннюю чувствительность к глифосату.
Этот метод был использован для количественной оценки изменений чувствительности белка EPSPS на микроэволюционном уровне. Мы выявили изменения в статусе чувствительности в 12 из 32 тесно связанных групп проанализированных прокариот. Таким образом, непрерывное использование продуктов на основе глифосата может привести к микробному дисбактериозу в растительных, животных и почвенных микробиомах.
Обеспечить качество процедур до и после ПЦР для получения оптимальных библиотек ампликонов. Также убедитесь, что последовательность белка EPSPS не является частичной перед использованием программного обеспечения. В полевых экспериментах убедитесь, что не допускайте загрязнения контрольных элементов глифосатом.
