Многие субъединичные вакцинные антигены-кандидаты являются мембранными белками. Исторически сложилось так, что их было трудно производить и очищать в достаточных количествах. С помощью этого метода мы можем создавать интересующие нас антигены, встроенные в липидную мембрану, чтобы помочь обеспечить подтверждение, подобное нативному.
Этот процесс также облегчает составление рецептуры с интересующими адъювантами. Бесклеточная экспрессия позволяет быстро производить интересующие белки в их нативной структуре без меток. Этот метод также является масштабируемым, и мы уже работаем с коммерческими компаниями над разработкой составов вакцин с использованием этого процесса.
Мы демонстрируем этот процесс для антигена хламидиоза, но этот процесс может быть легко адаптирован для получения интересующих нас антигенов, независимо от того, являются ли они мембранными белками или нет. Этот процесс может быть применим как к разработке вакцин против патогенов, так и против рака. Для начала подготовьте MOMP-tNLP, используя бесклеточный метод.
Разморозьте восстановительный буфер из набора для экспрессии бесклеточного белка за два часа до начала реакции и добавьте в буфер ингибитор протеазы, не содержащий ЭДТА. Используйте набор, предназначенный для запуска пяти реакций объемом один миллилитр. Для каждой реакции объемом один миллилитр добавьте 525 микролитров восстановительного буфера во флакон с лизатом E.coli и сверните его до растворения.
Добавьте 250 микролитров восстановительного буфера в реакционную бутылку, содержащую добавку, и растворите путем прокатки. Затем добавьте 8,1 миллилитра буфера для восстановления в бутылку для реакционного корма и сверните ее до растворения. Во флакон с аминокислотной смесью добавьте три миллилитра восстановительного буфера, чтобы растворить его.
В другой флакон метионина добавьте 1,8 миллилитра восстановительного буфера, растворите его и храните на льду. Добавьте 225 микролитров восстановленной смеси, 270 микролитров восстановленной аминокислотной смеси без метионина и 30 микролитров восстановленного метионина во флакон с лизатом E.coli. Далее добавьте в смесь 400 микролитров смеси DMPC/телодендримера, 15 мкг плазмиды MOMP и 0,6 мкг дельта-49ApoA1 и перемешайте.
Аликвота 20 микролитров общего раствора в пробирке объемом 1,5 миллилитра Для контрольной реакции, экспрессирующей GFP. Приготовьте кормовой раствор, добавив 2,65 миллилитра восстановленной аминокислотной смеси без метионина и 300 микролитров восстановленного метионина. Перелейте один миллилитр реакционного раствора во внутреннюю реакционную камеру в бесклеточном реакционном наборе и запечатайте его.
Наполните внешнюю камеру реакционного сосуда 10 миллилитрами питательного раствора и закройте ее. К 20-микролитровым аликвотам реакционной смеси добавляют 0,5 мкл контрольной плазмиды GFP. Поместите реакцию в шейкер со скоростью 300 оборотов в минуту на 18 часов при температуре 30 градусов по Цельсию.
Следите за реакцией под ультрафиолетовым светом через 15 минут на предмет флуоресценции из-за синтеза GFP. Очистите комплекс наночастиц MOMP-tNLP от внеклеточной реакционной смеси методом иммобилизованной никелевой аффинной хроматографии с использованием HIS-метки на белке дельта-49ApoA1. Перелейте один миллилитр 50%-ной суспензии очищающей смолы HIS-tag в одноразовую хроматографическую колонку объемом 10 миллилитров и добавьте три миллилитра связующего буфера для уравновешивания.
После этого слейте воду из буфера и добавьте в смолу 250 микролитров связующего буфера. Извлеките 20 микролитров бесклеточной реакционной смеси для анализа SDS-PAGE. Добавьте оставшуюся бесклеточную реакционную смесь с уравновешенной смолой и инкубируйте в лабораторном коромысле в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия.
Снимите крышку колонки и промойте ее 500 микролитрами связующего буфера. Добавьте промывочную жидкость в колонку и соберите проточную жидкость для анализа SDS-PAGE. Промойте колонку одним миллилитром промывочного буфера с 20-миллимолярным имидазолом шесть раз и соберите фракции.
Во время второй промывки используйте пипетку объемом один миллилитр, чтобы перемешать смолу. Элюируют MOMP-tNLP в шесть 300-микролитровых фракций элюирующего буфера I, содержащего 250-миллимолярный имидазол, и окончательного элюирования с 300 микролитрами элюирующего буфера II, содержащего 500-миллимолярный имидазол. Во время второго элюирования энергично перемешайте смолу, пипетируя вверх и вниз с помощью пипетки объемом один миллилитр.
Используйте гелевый имидж-сканер для съемки изображений с длиной волны 600 нанометров. Затем количественно определите количество различных белков в наночастицах с помощью анализа SDS-PAGE с использованием белкового стандарта. Нарисуйте стандартную кривую, используя плотности каналов MOMP.
Затем определяют MOMP-составляющую наночастиц с помощью стандарта. Растворите образцы с помощью SDS-PAGE и перенесите стопки гелей с помощью коммерческой системы сухого блоттинга для анализа методом вестерн-блоттинга. Извлеките кляксы из стопки и инкубируйте их в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия в блокирующем буфере, содержащем 0,2%TWEEN 20 и 0,5 микрограмма на миллилитр MAb40 или 0,2 микрограмма на миллилитр антитела MAbHIS antiHIS-tag, направленные против HIS-tag из белка delta-49ApoA1.
Промойте каждую кляксу PBST три раза в течение пяти минут за одну стирку. Инкубируют блоты в течение одного часа в блокирующем буфере, содержащем вторичные антитела, конъюгированные с флуорофором, в разведении 1:10 000. Повторите промывку с PBST и сделайте снимок с помощью флуоресцентного тепловизора после окончательной стирки.
С помощью аппарата для дот-блоттинга промокните три микрограмма MOMP-tNLP и опорожните tNLP. Разработайте и заблокируйте кляксы, используя тот же метод для вестерн-блоттинга. Заморозьте смешанный раствор на сухом льду и лиофилизируйте его на ночь с помощью лиофилизатора.
Храните высушенные составы при температуре минус 20 градусов по Цельсию. При необходимости восстановите лиофилизированные tNLP водой, не содержащей эндотоксинов, и прокатите ее для растворения и регидратации. Диализируйте раствор PBS и удалите трегалозу с помощью диализной мембраны с отсечкой на 3,5 килодальтона.
Центрифугируйте раствор наночастиц в вакуумном концентраторе перед добавлением адъюванта. Контролируйте объем образца через 20–30 минут, чтобы предотвратить полное высыхание. В шкафу биобезопасности добавьте адъювант в стерильных условиях.
Используя аналитическую эксклюзионную хроматографию, проанализируйте рецептуру для успешного внедрения. Храните адъювантные MOMP-tNLP и пустые tNLP при температуре четыре градуса Цельсия до 14 дней. Анализ стабильности рецептуры tNLP с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии.
Анализ SDS-PAGE MOMP-TLP был проведен с помощью сродственной хроматографии никеля, которая продемонстрировала, что бесклеточная реакционная смесь имеет высокие уровни экспрессии как для MOMP, так и для белков дельта-49ApoA1. С помощью гель-денситометрии концентрацию MOMP количественно определяли с помощью очищенного рекомбинантного MOMP с известной концентрацией в качестве стандарта. Для определения образования олигомеров SDS-PAGE MOMP и MOMP-tNLP обрабатывали теплом и DTT, которые показали отчетливые полосы для MOMP и дельта-49ApoA1.
Против белка MOMP был использован вестерн-блоттинг-анализ с использованием антитела MAb40, который выявил полосчатый рисунок, подтверждающий образование олигомеров белком MOMP в его неденатурированном состоянии. Дот-блоттинг-анализ проводили в присутствии антител MAb40 и MAbHIS, что свидетельствовало об образовании MOMP-tNLP. Тем не менее, пустой tNLP показал положительный сигнал для MAbHIS.
Сыворотки от иммунизированных мышей, которым вводили адъювантный MOMP-tNLP, продемонстрировали сильное связывание MOMP и указывали на то, что MOMP-tNLP может вызывать иммунный ответ. Поскольку этот протокол генерирует белок из ДНК, важно избегать загрязнения реакции ДНКазой, РНКазой, а также посторонними ДНК и РНК. Любые материалы или реагенты, используемые в реакциях, не должны содержать молекул такого типа.
После экспрессии, очистки и добавления адъювантов эти вакцины-кандидаты могут быть оценены на соответствующих животных моделях для интересующих патогенов для оценки маркеров иммунной активации или оценки защиты во время испытания. Что касается хламидиоза, то основной белок внешней мембраны, или MOMP, в течение многих лет считался ведущим антигеном-кандидатом для субъединичных вакцин, но его было трудно производить в масштабах, необходимых для применения вакцины. Внеклеточная коэкспрессия этого мембранного белка является жизнеспособным способом начать продвигать этот белок к оценке на животных моделях, таких как мыши, и, в конечном итоге, к тестированию на людях.
