Этот протокол дает представление о цветении водорослей и о том, как эффективно контролировать токсичные виды водорослей. Процедура помогает обеспечить раннее предупреждение о цветении водорослей, чтобы защитить сообщество от связанных с этим повреждений. Анализ метабаркодирования может обнаружить много видов в образце одновременно, но он требует сложных процедур.
Этот протокол визуально объясняет каждый шаг, чтобы помочь свести к минимуму человеческие ошибки во время анализа. Процедуры микроскопии будут продемонстрированы Генри Кэмероном из Университета Антофагаста, сбор образцов Джонатаном Вилугроном из Института Фоменто Пескеро, предварительная обработка образцов Карен Вергара из Университета Лос-Лагоса и анализ метабаркодирования Игнасио Риллингом и Марко Кампосом из Университета Ла Фронтера. Начните с сбора трех литров образца воды из целевого места.
Отфильтруйте один литр воды для анализа 16S рРНК через тандемную фильтрацию для разделения свободно живущих и прикрепленных бактерий. Затем отфильтруйте еще один литр воды для анализа 18S рРНК через одну фильтрацию с мембраной 0,2 микрона. Затем, используя стерильные хирургические ножницы, разрезают фильтрованную мембрану пополам, оборачивают одну половину алюминиевой фольгой для хранения, а другой половиной приступают к извлечению ДНК методом Челекса.
Для микроскопического анализа перенесите один миллилитр образца воды на один миллилитр сетки с помощью пипетки. Понаблюдайте за образцом под микроскопом и запишите названия и количество видов фитопланктона. Очистите пипетки в ламинарной вытяжке с 70% этанолом с последующим воздействием ультрафиолета в течение 30 минут.
Для первого поколения ампликонов ПЦР аликвот 22,5 микролитра мастер-микса в полосе из восьми пробирок, за которым следуют 2,5 микролитра образца ДНК, затем запустите первый цикл ПЦР. Далее готовят 100 миллилитров 2%-агарозного Геля TBE, содержащего 10 микролитров гелевого пятна нуклеиновой кислоты. Как только гель будет готов, загрузите смесь, содержащую 1,5 микролитра днк-нагрузочного красителя и четыре микролитра продукта ПЦР и выполните электрофорез при 100 вольтах в течение 30 минут.
Затем визуализируйте гель под ультрафиолетовым светом и подтвердите наличие полосы от 500 до 600 пар оснований. Недостающие ампликоны иногда могут быть решены путем разбавления образца до 1000 раз водой. Затем используйте систему очистки ДНК на основе магнитных шариков для очистки первых продуктов ПЦР, затем перенесите 20 микролитров каждого очищенного первого продукта ПЦР на новую 96-луночную пластину и запечатайте пластину пленкой Microseal.
Храните пластину при минус 20 градусах Цельсия до следующего шага. Для индексации второй ПЦР, после разбавления всех индексных единиц и индексных двух праймеров до одной микромолярной концентрации водой класса ПЦР в восьми пробирных полосках ПЦР, расположите индекс одной грунтовки в горизонтальном ряду и индексируйте две грунтовки в вертикальном ряду. Затем, используя многоканальную пипетку на 2,5 микролитра индекса по одной грунтовке к каждой скважине новой 96-луночной пластины.
Затем добавьте в каждую лунку 12,5 микролитров готовой к горячему запуску рецептуры. Затем добавляют 2,5 микролитра индекса двух праймеров и 7,5 микролитра очищенного первого продукта ПЦР в каждую лунку. После перемешивания путем пипетки вверх и вниз 10 раз накройте пластину пленкой Microseal и запустите второй цикл ПЦР.
После завершения ПЦР поместите экранную ленту ДНК в анализатор фрагментов. Смешайте два микролитра буфера образца в трех микролитрах второго ампликона ПЦР в новых восьми полосках трубки и вставьте полоски в анализатор фрагментов, чтобы начать анализ. Убедитесь, что вторые ампликоны ПЦР составляют примерно 613 пар оснований для генов 16S и 18S рРНК.
Очистите вторые продукты ПЦР с помощью системы очистки ДНК магнитных шариков, как было продемонстрировано ранее. Затем измерьте их концентрацию в ДНК с помощью спектрофотометра количественной оценки нуклеиновых кислот. В новой 200-микролитровой 96-луночной пластине разбавьте каждый очищенный второй продукт ПЦР стерильной водой для ПЦР до четырех наномолей.
Следующий шаг вперед, протокол должен быть выполнен без остановки. Aliquot три микролитра каждого разбавленного второго продукта ПЦР в новой стерильной 1,5-миллилитровой трубке для создания объединенной библиотеки. Всегда держите трубку при четырех градусах Цельсия.
За сутки до секвенирования снимите предварительно заполненный готовый к использованию реагентный картридж с минус 20 градусов Цельсия и поместите его на четыре градуса Цельсия для размораживания. В день секвенирования установите тепловой блок, подходящий для 1,5-миллилитровых центрифужных трубок, до 96 градусов Цельсия и поместите буфер гибридизации на лед. Затем разбавьте гидроксид натрия молекулярного класса водой и разбавьте готовую к использованию контрольную библиотеку с буфером TE.
Смешайте 16 микролитров из четырех наномолей или объединенной библиотеки образцов с четырьмя микролитрами контрольной библиотеки в новой трубке, помеченной как один. Затем смешайте 10 микролитров образца из пробирки с 10 микролитрами гидроксида натрия в новой пробирке, помеченной как две. После вихря и короткого отжима инкубируют трубку две при комнатной температуре в течение пяти минут, затем добавляют 980 микролитров гибридизационного буфера.
Затем в новой трубке, помеченной как три, смешайте 260 микролитров образца из двух пробирок с 390 микролитрами буфера гибридизации. После перемешивания содержимого путем переворачивания трубки инкубируют его при 96 градусах Цельсия в течение двух минут с последующей инкубацией на льду в течение двух минут. Затем извлеките картридж из холодильника и настройте образец листа для секвенирования с каждым соответствующим индексом один и индексом двух адаптеров.
После извлечения проточной ячейки из комплекта MiSeq V3 аккуратно очистите проточную ячейку стерильной ПЦР-водой молекулярного класса. Загрузите весь объем трубки три в картридж. Затем в программном обеспечении для работы с прибором выберите последовательность и следуйте инструкциям по вставке проточной ячейки, буфера включения и картриджа.
Наконец, загрузите образец листа и нажмите Run, чтобы начать реакцию. Выполнение этой последовательности занимает от трех до пяти дней. Метабаркодирующий анализ 18S рРНК для идентификации видов водорослей, присутствующих в морской воде, собранный в Metri Puerto Montt, Чили, 19 февраля 2019 года, дал 13 750 считываний, с более чем 30 видами водорослей.
Вид Navicula был доминирующим альго с относительной численностью 70,73% Кроме того, достаточная численность наблюдалась для видов Micromonas, Chaetoceros, Scrippsiella и Prorocentrum. Вид Pseudochattonella, один из основных причин вредного цветения чилийских водорослей, имеет 0,52% изобилия. В соответствии с анализом гена 18S рРНК микроскопические наблюдения показали, что Navicula является доминантой, а Prorocentrum - второстепенным видом.
12,6% небольших, неидентифицируемых клеток фитопланктона, зарегистрированных микроскопией, могут быть Micromonas, согласно результатам 18S рРНК. Анализ метабаркодирования 16S рРНК для идентификации видов бактерий в том же образце воды показал 31 758 считываний с более чем 30 видами бактерий. Доминирующим свободноживущим видом бактерий был Amylibacter, с относительной численностью 20,02%, за которым следуют Cladella с 13,53% и Algiphilus с 7,06%.
Относительное изобилие всех бактериальных родов в порядках, обнаруженных из морской воды в течение пяти месяцев, построено на графике и время, проведенное для анализа изменения популяции определенных организмов. Очень важно быть очень чистым. Следует избегать загрязнения образца с помощью спиртовой салфетки, ультрафиолетового излучения или автоклавирования материала.
Разбавленные растворы не следует использовать повторно, а трубки всегда должны быть закрыты. Обнаружение водорослей с помощью метабаркодирования должно быть сопряжено с микроскопией. Доминирующие виды могут быть подтверждены микроскопией, гарантирующей отсутствие человеческой ошибки во время процессов метабаркодирования.
Вредное цветение водорослей наносит ущерб морской экосистеме и прибрежной экономике. В Чили цветение водорослей убивает сельскохозяйственных лососей, повреждая агуакультуры. Этот анализ метабаркодирования повысит эффективность предупреждений о цветении в Чили.
