Рассечение планарийных яичников для ультраструктурного анализа и окрашивания антителами

Целью данного метода является препарирование яичников планарии Schmidtea mediterranea для клеточного и субклеточного анализа биологии ооцитов с помощью ПЭМ или окрашивания антителами. В этом протоколе используется короткий этап фиксации для облегчения локализации и рассечения планарных яичников, что обеспечит глубину и качество визуализации, которые ранее были недоступны. Самой большой проблемой для того, кто никогда раньше не выполнял эту методику, будет локализация яичников после фиксации.

Будет полезно ознакомиться с анатомией половых планарий перед экспериментом. Подготовьтесь к эксперименту, кормя половых планарий органической печеночной пастой два раза в неделю для достижения половой зрелости. Обрабатывайте половозрелых червей 5%-ным N-ацетил-L-цистеином, или NAC, в чашке комнатной температуры в течение пяти минут.

Замените NAC на 10 миллилитров свежеприготовленного 4%-ного параформальдегида, и зафиксируйте червей на один час при комнатной температуре с периодическим встряхиванием. Начните вскрытие через 10 минут после добавления 4% параформальдегида по мере фиксации червей. Обратите внимание на пигментацию эпителия, чтобы найти вентральные нервные канатики, которые выглядят как две линии с более светлой пигментацией, идущие от передних головных ганглиев к хвосту.

Определите местонахождение предполагаемых яичников, наблюдая за пигментацией, и подтвердите их положение. С помощью двух хирургических ножей сделайте надрезы сзади и спереди от яичников, чтобы полностью удалить передние и задние фрагменты червей. Используйте один нож для закрепления червя, а другой нож для вскрытия.

Очистите нож, которым сделаны надрезы. Чтобы разделить две завязи, разрежьте по средней линии фрагмент завязи, затем переверните фрагмент вентральной стороной вниз. Используйте две пары остроконечного пинцета типа 5-SA, чтобы отклеить дорсальную ткань, чтобы обнажить кишечник.

Аккуратно удалите ветки кишки, расположенные над вентральными тканями, с помощью кончика пинцета или мягкой щетки, чтобы обнажить завязь. Удалите окружающие ткани, чтобы удалить яичник. Выньте яичники и переложите их в 1,5-миллилитровую трубку, чтобы промыть 1 миллилитром PBS.

Дорсальная и вентральная пигментация была использована для определения положения яичников. Излишки ткани были обрезаны поэтапно. Как только яичник обнажался, окружающие ткани обрезались.

Яичники, содержащие несколько типов соматических клеток, использовались как для ультраструктурного анализа, так и для иммунофлуоресцентного окрашивания. Рассеченные яичники позволяют получить высококачественную визуализацию клеточной и субклеточной анатомии ооцитов. Эта процедура должна позволить проводить эксперименты по РНК-интерференции для изучения молекулярной регуляции биологии ооцитов.

Этот метод привел к открытию нового явления в ооцитах плоского червя, заключающегося в том, что ядерная оболочка распадается на пузырьки, инкапсулирующие ядерные белки, вместо того, чтобы оставаться нетронутыми, что называется закрытым митозом, или распадается на части, что является открытым митозом.