Дегенерация межпозвоночных дисков приводит к высокой степени нарушений и болевых ощущений. Наш протокол позволяет нам исследовать морфологически развитие диска и его изменения в дегенерации. Плотная коллагеновая сеть первого типа обычно затрудняет анализ межпозвоночного диска с помощью микроскопии.
С помощью оптического сечения мы можем исследовать 3D-расположение хондроцитов в разных тканях. Начните с помещения интраоперационно полученных, образцов межпозвоночных дисков или IVD в DMEM, дополненных 2% объемом по объему пенициллина-стрептомицина и 1,2% объемом по объему амфотерицина B, сразу после сбора, храните образцы IVD при четырех градусах Цельсия до дальнейшей обработки. При замораживании разморозьте образцы IVD человека при комнатной температуре и определите происхождение ткани IVD человека на основе микроскопических свойств, таких как плотность колледжа и ориентация.
Чтобы собрать ткань бычьего диска, возьмите сегмент движения, состоящий из IVD с двумя соседними позвонками и с помощью хирургического лезвия No 15, рассекните весь бычий диск от субхондральной кости, переверните диск, чтобы достичь центрированных областей. После выявления различных областей хряща используйте хирургический клинок No 20 или 22, чтобы вырезать интересующую область из всего диска. IVD из эмбрионов крупного рогатого скота с длиной коронки-крестца менее 20 сантиметров должны быть обработаны без рассечения.
Выполняется декальцинация ткани, как описано в рукописи. Подтвердите успешную декальцинацию, если игла 20 калибра проникает в ткань диска или, если применимо позвонки без заметного сопротивления. Нанесите образцы тканей в десятикратном объеме 4%-ного раствора формальдегида в PBS на ночь при четырех градусах Цельсия.
На следующий день поместите ткань в водорастворимую встраиваемую среду на ручку Криотома, чтобы образовалась либо осевая плоскость, либо плоскость, которая перпендикулярно разрезает коллаген первого типа. Используйте стандартный криотом для разрезания внедренной ткани толщиной 70 микрометров в образцах человека и 40 микрометров в образцах крупного рогатого скота. Соберите секции на стеклянной горке, прежде чем промывать секции три раза PBS, добавьте подходящий флуоресцентный краситель, а затем монтажную среду и накройте секции крышкой.
Поместите слайд с пятнистым сечением ткани на держатель образца флуоресцентного микроскопа, запустив устройство освещения структуры, выполните визуализацию одного поля зрения с флуоресцентными фильтрами и адекватным освещением. Используя программное обеспечение для оптимизации изображений, совместимое с флуоресцентным микроскопом, обрабатывайте изображения, оптимизируя интенсивность и яркость. Чтобы визуализировать раздел в целом, используйте технику мозаичного изображения, открыв 60 настроек сбора с панели инструментов и настроив настройки мозаики в регистре мозаики.
Для этого определите количество столбцов и строк изображения поля зрения, которые впоследствии будут объединены в одно обзорное изображение, нажмите кнопку настройки и настройте коррекцию фокуса отдельных плиток. Постобработайте снимки, оптимизируя интенсивность и яркость. Для анализа пространственной организации хондроцитов используйте 3d-функцию, встроенную в программное обеспечение, регулируя настройки Z-стека с помощью кнопки запуска / остановки, определите параметры сканирования, такие как начальные и стоп-позиции по оси Z и расстояние до среза.
Определите отдельные клеточные паттерны и используйте плагин подсчета клеток для количественного анализа клеточных паттернов, рассчитайте плотность клеток путем деления подсчитанных клеток на размер выбранной области интереса. Архитектура IVD с его плотной коллагеновой волоконной сетью в кольце и более мягким ядром может быть распознана на мозаичных изображениях, сделанных в осевой и сагиттальной плоскости. В увеличенных областях из мозаичных изображений были замечены различные пространственные организационные паттерны хондроцитов, такие как одиночные клетки, пары и струны.
Изучение различных стадий развития и созревания фиброза бычьего кольцевого кольца показало непрерывное снижение клеточной плотности во время развития эмбрионального диска. С другой стороны, увеличение клеточной плотности и образование кластеров наблюдались в диске взрослого человека во время дегенерации. Плотность клеток на ранних стадиях развития IVD при фиброзе бычьего кольцевого кольца и пульпозном ядре крупного рогатого скота быстро уменьшалась вплоть до рождения.
С помощью канальной визуализации IVD с Epitome позволила визуализировать 3D-архитектуру пространственных паттернов, таких как цитоплазма и ядро, в интактном IVD одиночном, а также пары хондроцитов были обнаружены. Тогда как в дегенерированном анолусе были обнаружены кластеры клеток. Наиболее сложной частью является выделение ткани по ее происхождению и коррекция встроенного для срезания.
Это важно для получения надежных результатов. Правильно рассеченная и выбранная ткань IVD из разных стадий и происхождения позволяет углубить анализ путем дальнейшего биохимического и биомеханического анализа, такого как ИФА или атомно-силовая микроскопия.
