Эндолимфатический мешок необходим для нормального развития внутреннего уха. Поскольку он недоступен in situ для структурных, физиологических и молекулярных исследований, его препарирование на животных моделях, особенно на мышах, имеет важное значение. Рассечение и препарирование эндолимфатического мешка чрезвычайно затруднены из-за его тонкой, нежной эпителиальной структуры, а также близости и прилегания к соседним тканям.
Наш подход облегчает визуализацию и идентификацию мешочка и его отделение от прилегающих тканей. Заболевания и расстройства, влияющие на нормальную функцию эндолимфатического мешка, могут привести к потере слуха и равновесия. Наша методика имеет важное значение для выяснения клеточных, молекулярных и физиологических процессов, лежащих в основе функций эндолимфатического мешка.
Демонстрировать процедуру будет Хён Джэ Ли (Hyun Jae Lee), приглашенный научный сотрудник моей лаборатории. Начните с организации подготовки внутреннего уха в 35-миллиметровой чашке для культуры тканей, содержащей PBS, с корнем восьмого черепного нерва, направленным вверх. С помощью щипцов No 4 удерживайте ткань у улитки и определите вестибулярный водопровод, передний и задний полукружные каналы, общую голень и сигмовидный синус.
Затем с помощью иглы 27 калибра, установленной на одномиллилитровом шприце, можно надрезать твердую мозговую оболочку и вестибулярный водопровод, а также нижележащие соединительные ткани, окружающие эндолимфатический мешок. После того, как вы сделаете разрез в соединительной ткани латерально к эндолимфатическому мешку, используйте щипцы, чтобы удерживать соединительную ткань и отслаивать ее, оттягивая от височной кости. Осторожно удалите оставшийся мусор и отделите эпителий эндолимфатического мешка от окружающих тканей.
Для рассечения вскрытого эндолимфатического мешка придерживайте ножевую часть препарата, чтобы наблюдать за поперечным сечением просвета. Затем вставьте иглу 27 калибра в просвет и переместите ее, чтобы разрезать эндолимфатический мешок на два листа. Придерживайте края каждой листовидной ткани щипцами и отделяйте их друг от друга.
В репрезентативном анализе средний сагиттальный срез черепа этих мышей до и после удаления половины мозга визуализировался с помощью флуоресценции tdTomato. Эндолимфатический мешок был хорошо виден даже без вскрытия. Внутреннее ухо мышей на эмбриональный день 16,6, а также постнатальный день 5 и 30 были изолированы.
Эндолимфатические мешочки наблюдались при большем увеличении. У мышей P30 эндолимфатический проток трудно изолировать из-за его инкапсуляции в кости. Иммуногистохимию интактных эндолимфатических мешочков из E16.5 и P5 изучали с мечением антител к SLC26A4 и фаллоидина.
Фаллоидин использовался для выделения эндолимфатического мешка и соединительной ткани вокруг него. Изображения открытого эпителия эндолимфатического мешка с большим увеличением в точке P5 показывают, что SLC26A4, помеченный зеленым цветом, локализован в апикальной области подмножества клеток. Самое главное, что нужно помнить при попытке этой процедуры, — это быть очень осторожным, чтобы не повредить эндолимфатический мешок.
Неподвижная ткань эндолимфатического мешка, выделенная с помощью этого подхода, может быть использована для гибридизации in situ, объема РНК и иммуногистохимии. Живая ткань может быть использована для подготовки РНК для анализа транскриптома и для физиологии. Этот подход был использован для изучения транскриптома эндолимфатического мешка либо в целом, либо в анализе РНК-секвенирования одиночных клеток, чтобы внести свой вклад в характеристику различных типов его клеток.
