Это видео будет посвящено подготовке дрожжей сальмонеллы к криоэлектроно-томографии Мы пройдем рабочий процесс от культивирования клеток до криоэлектроно-томографии Saccharomyces cerevisiae культивируются для приготовления ионного образца в суспензии Рекомендуется работать в стерильных условиях внутри ламинарного проточная коробка десять миллилитров стерильных дрожжей, извлеченных в среду для культивирования клеток, добавляют в стерилизную колбу культивирования один миллилитр стерильной двадцатипроцентной глюкозы добавляется в колбу со средой для культивирования одну колонию дрожжей тщательно собирают с нашей культивационной пластины и переносят в подготовленную питательную среду в культивационной колбе, затем накривают фольгой и хорошо перемешивают для диспергирования клеток, культуру клеток помещают в инкубатор и культивируют при тридцати градусах с постоянным перемешиванием до достижения экспоненциальной фазы культуры дрожжевых клеток выращивают до экспоненциальной фазы и измеряют физическую плотность клеток измеритель удержания против чистой среды в качестве эталонного образца клеточной культуры концентрируют до OD1 или OD30 в дополнение к пяти процентам глицерина перед бланш замораживанием Поверхность электромикроскопических решеток очищается и активируется для применения клеточной суспензии плазменными сетками, помещаются в камеру тлеющей разрядки лицом к углу стороной вверх и процедура плазменной очистки устанавливается на тридцать-сорок пять секунд ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫЕ сетки имеют теперь и они готовы к ячейке Пример применения Витрификация суспензии дрожжевых клеток на эм-сетках производится путем замораживания бланша в жидкий этан с помощью машины Vitrobot Приготовление жидкого этана происходит путем сжижения газа этана в металлической чашке, охлаждаемой жидким азотом ЭМ сетка с клеточной суспензией смачиваемой фильтровальной бумагой с обратной стороны и неадгезионным пластиком, изогнутым с передней углеродной стороны Температура внутри камеры Vitrobot устанавливается на восемнадцать градусов и влажность до стопроцентного времени ожидания, время промокания и сила пятна устанавливаются на экране Vitrobot, а также Сетка тлеющего разряда выбирается пинцетом Vitrobot и крепится к инструменту в трех точках пять микролитров Saccharomyces cerevisiae подвеска наносится на углеродную сторону сетки внутри климатической камеры Vitrobot Подвеска должна быть правильно перемешана перед каждым применением сетки сетки, которая замерзает в жидком этане электромикроскопические сетки с остеклованными ячейками хранятся в условиях жидкого азота или вмонтируются в сетку картриджа для загрузки в крио-SEM микроскоп Сетка с остеклованными ячейками затем закрепляется в картридж сетки, пригодный для загрузки как в SEM, так и в TEM микроскопы C-clip ring устанавливается на клипсаторный инструмент и охлаждается в жидкой азотной сетке, помещается на сетку картриджа углерода лицом вниз и обрезается с помощью Затем образец кольца C-clip помещается в специальную сетку Образцо для приготовления ламилы загружается в двухлучевой микроскоп FIB/SEM и подгоняется к криоступенчатой камере подготовки загрузочный котел должным образом охлаждается и заполненный жидким азотом держатель образца, называемый челноком, помещается в и охлаждается, а сетка с образцом переносится из хранилища дьюара в горшок, а решетки помещаются в две щели в Челночная карбоновая сторона с ячейками, обращенными вверх в случае использования картриджей fiB сетки, вырез из сетки картриджа должен быть тщательно выровнен до двенадцати часов, в челночной сетке затягиваются винтом и шаттл переворачивается вниз в положение загрузки, погрузочная банка помещается в передаточную станцию и накрывает крышкой Передаточная камера с загрузочным горшком помещается на верхнюю часть крышки и прокачивается через низковакуумный челнок с решетками крепится на стержень и закрывается внутри малой передаточной камеры, собираются в заготовительную камеру перекачиваются и шаттл вставляется на криоступенчатую ступень в высокомакуумную SEM-камеру, ступень наклоняется до сорока пяти градусов и перемещается на четыре миллиметра в центральное положение сетки, вставляя иглу системы впрыска газа, создает защитный слой органического на биологическом образце от радиационного повреждения во время фокусировки Ионно-лучевые фрезерные решетки затем напыляются тонким покрытием из неорганического металла для создания проводящего слоя на биологическом материале, сфокусированный ионный пучок фрезерование ламели в кластере ячеек или монослое производится в несколько шагов стадия перемещается в область угла фрезерования, найдена область и сверху и снизу фрезерные схемы создаются грубые ламели с постепенным уменьшением тока FIB и толщины ламели окончательная полировка ламели составляет выполнен только с верхним рисунком и низким током FIB, чтобы избежать повреждения передней части и эффекта занавески на поверхности ламели Электронный пучок показывает прогресс в процессе фрезерования здесь мы можем видеть окончательную полированную ламель Конечная толщина ламели должна быть менее двухсот пятидесяти нанометров, чтобы быть прозрачной для передачи электронного пучка иллюстрация ламели, фрезероированной в кластере ячеек и монослоях с плюсами и минусами Сетки обоих типов образцов с ламали очень мягко переносятся через камеру подготовки обратно в загрузочный котел, охлаждаются и заполняются свежим и чистым жидким азотом во избежание загрязнения льдом измельченные сетки ламали удаляются из шаттла и возвращаются обратно в сетку, образец с фрезерованным ламали окончательно передается в просвечивающую электронную криомикроскопную сетку, которая должна быть повернута на девяносто градусов перед установкой в кассету автозагрузчика ТЭМ для обеспечения правильной ориентации ламели относительно наклонного доступа ТЭМ ламили экранируются и локализуется область, интересуемая для получения криоэлектронографических данных, главная ось ламели перпендикулярна оси наклона микроскопа, чтобы увидеть правое поле зрения при больших углах наклона Дозиметрический метод используется для сбора криоэлектронографических данных собранная томограмма затем обрабатывается в программном обеспечении Etomo и монослой сегментируется в Amira Программное обеспечение В этом протоколе мы показали вам, как эффективно подготовить образец дрожжевой клетки для ламельной микромашины с помощью криофокусированного ионно-пучкового фрезерования и как подготовить и обработать данные электронной томографии и клеточные ламали
