هذا الفيديو سوف تركز على إعداد السالمونيلا الخميرة للتصوير المقطعي الكريو الإلكترون سوف نذهب من خلال سير العمل من زراعة الخلايا إلى التصوير المقطعي بالتبريد الإلكترون Saccharomyces cerevisiae تزرع لإعداد عينة أيون في تعليق فمن المستحسن للعمل في ظروف معقمة داخل مربع تدفق صفح يتم إضافة عشرة ملليلتر من الخميرة المعقمة المستخرجة إلى المتوسطة لزراعة الخلايا لتعقيم قارورة زراعة ملليلتر واحد من الجلوكوز 20 في المئة معقمة إلى القارورة مع زراعة متوسطة مستعمرة خميرة واحدة يتم انتقاؤها بعناية من لوحة الزراعة لدينا ونقلها إلى وسيط النمو المعدة في قارورة زراعة قارورة زراعة قارورة زراعة ثم يتم تغطيتها مع احباط ومختلطة جيدا لتفريق الخلايا يتم وضع ثقافة الخلية في الحاضنة وتزرع في ثلاثين درجة مع التحريض المستمر حتى يتم التوصل إلى المرحلة الأسية نمت ثقافة خلايا الخميرة تصل إلى مرحلة الأسي ويتم قياس الكثافة المادية الخلية من قبل عقد متر ضد وسيط نظيفة كما يتركز نموذج المرجعية ثقافة الخلية إلى OD1 أو OD30 بالإضافة إلى خمسة في المئة من الجلسرين قبل بلانش تجميد الكهربائية المجهرية الشبكات السطح يتم تنظيف وتفعيلها لتطبيق تعليق الخلية من قبل شبكات البلازما توضع في غرفة تفريغ توهج تواجه الجانب الكربوني حتى ويتم تعيين إجراء تنظيف البلازما إلى ثلاثين إلى خمسة وأربعين ثانية شبكات EM لديها الآن وأنها مستعدة للخلية عينة تطبيق Vitrification تعليق خلايا الخميرة على شبكات EM يتم عن طريق تجميد بلانش في الإيثان السائل باستخدام آلة Vitrobot إعداد الإيثان السائل يحدث عن طريق تسييل غاز الإيثان في كوب معدني تبريده مع شبكة النيتروجين السائل EM مع تعليق الخلية هو ملطخة بورق تصفية من الجانب الخلفي والبلاستيك غير لاصقة عازمة من درجة حرارة الجانب الكربون الأمامي داخل غرفة Vitrobot يتم تعيين إلى يتم تعيين ثمانية عشر درجة والرطوبة إلى مائة في المئة وقت الانتظار، والوقت لطخة وقوة لطخة على شاشة Vitrobot وكذلك يتم اختيار شبكة تفريغ توهج من قبل ملاقط فيتروبوت وشنت على الصك ثلاث نقاط خمسة microliters من Saccharomyces cerevisiae تعليق يتم تطبيقها على الجانب الكربوني من الشبكة داخل تعليق غرفة المناخ Vitrobot يحتاج إلى أن تكون مختلطة بشكل صحيح قبل كل تطبيق لشبكة الشبكة هو بلانش المجمدة المجمدة في شبكات المجهر الكهربائي الإيثان السائل مع خلايا متهاوى يتم تخزينها في ظل ظروف النيتروجين السائل أو شنت في خرطوشة الشبكة للتحميل في شبكة المجهر CRYO SEM مع الخلايا المهزوتة ثم يتم تأمين في خرطوشة الشبكة مناسبة للتحميل على كل من SEM وTEM المجاهر C-مقطع حلقة شنت على أداة لقطة وتبريدها في شبكة النيتروجين السائل يتم وضعها على شبكة خرطوشة الشبكة الكربون التي تواجه أسفل وقص مع ثم يتم وضع عينة حلقة C-كليب في مربع الشبكة الخاصة عينة لإعداد lamila يتم تحميلها إلى شعاع مزدوج FIB / SEM المجهر وتناسب مع وعاء تحميل غرفة إعداد مرحلة التبريد يتم تبريده بشكل صحيح ومليء حامل عينة النيتروجين السائل يسمى يتم وضع المكوك في وتبريدها وكذلك مربع الشبكة مع عينة يتم نقلها من dewar التخزين إلى وعاء ويتم وضع الشبكات في فتحات اثنين في المكوك الكربون الجانب مع الخلايا التي تواجه في حالة استخدام خراطيش الشبكة FIB قطع من خرطوشة الشبكة ينبغي أن تكون محاذاة بعناية إلى الساعة الثانية عشرة في شبكات المكوك يتم تشديد من المسمار ويتم قلب المكوك وصولا الى تحميل موقف تحميل وعاء يوضع في محطة نقل وتغطي مع غرفة نقل الغطاء مع وعاء التحميل يتم وضعها على الجزء العلوي من الغطاء وضخها من خلال وعاء التحميل يتم تثبيت المكوك فراغ منخفضة مع شبكات على قضيب ومغلقة داخل غرف غرفة نقل صغيرة التي تم جمعها إلى غرفة إعداد ويتم إدراج المكوك على مرحلة التبريد في مرحلة غرفة SEM فراغ عالية يميل إلى 45 درجة وانتقلت أربعة ملليمترات على موقف مركز الشبكة إدراج إبرة نظام حقن الغاز يخلق طبقة واقية من العضوية على العينة البيولوجية ضد الضرر الإشعاعي خلال مركزة ثم يتم البصق شبكات الطحن شعاع أيون المغلفة مع حجاب رقيقة من المعدن غير العضوي لإنشاء طبقة موصلة على المواد البيولوجية تركز طحن شعاع الأيونات من lamella في كتلة الخلية أو يتم نقل monolayer في مرحلة خطوات قليلة إلى منطقة زاوية الطحن من الفائدة ويتم إنشاء أنماط الطحن العلوي والسفلي يتم طحن lamella الخام مع انخفاض تدريجي من FIB الحالي وسماكة lamella يتم تلميع النهائي من lamella يؤديها فقط مع نمط العلوي والمنخفضة FIB الحالي لتجنب الضرر الأمامي وتأثير الستائر على lamella شعاع الإلكترون السطحي يظهر التقدم المحرز خلال عملية الطحن هنا يمكننا أن نرى lamella مصقول النهائي سمك النهائي من lamella يحتاج إلى أن يكون أقل من مائتين وخمسين نانومتر لتكون شفافة لنقل شعاع الإلكترون التوضيح من lamella طحن في كتلة الخلية ومونولابير مع إيجابيات وسلبيات يتم نقل كل من أنواع الشبكات عينة مع lamali بلطف جدا من خلال غرفة إعداد العودة إلى وعاء وعاء التحميل يتم تبريدها ومليئة النيتروجين السائل الطازجة والنظيفة لتجنب التلوث الجليدي من شبكات lamali المطحون تتم إزالتها من المكوك وإعادتها إلى عينة مربع الشبكة مع lamali المطحون يتم نقل أخيرا إلى شبكة المجهر الكريب الإلكترون الإرسال يجب أن تكون تسعين درجة استدارة قبل الإدراج في كاسيت TEM autoloader لضمان التوجه السليم لللاميلا فيما يتعلق الوصول إمالة TEM يتم فحص Lamili والمنطقة ذات الأهمية للحصول على البيانات الطبوغرافية الإلكترون المبرد هو محور Lamella الرئيسي هو عمودي على محور الميل من المجهر لرؤية الحقل الأيمن للعرض في زوايا الميل العالي يتم استخدام طريقة قياس الدوسيمتر لجمع بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني التبريد التي تم جمعها توموغرام ثم في برنامج إيتومو ومكونوليتر مجزأة في أميرا البرمجيات في هذا البروتوكول أظهرنا لك كيفية إعداد بكفاءة عينة خلية الخميرة لآلة صغيرة lamella باستخدام cryo تركز الطحن شعاع الأيونات وكيفية إعداد ومعالجة البيانات التصوير المقطعي الإلكتروني وlamli الخلية
