Метастазирование является основной причиной смертей, связанных с раком. Это явление возникает, когда раковые клетки отделяются от первичной опухоли, уходят в кровообращение, чтобы наконец достичь отдаленного органа-мишени. Как только эти отслоившиеся клетки попадают в кровь, мы называем их вторичными опухолевыми клетками.
Они представляют собой переменный материал, потому что, с одной стороны, они являются основным виновником образования метастазов, а с другой стороны, они проще, чем биопсия опухоли. Действительно, их можно собрать простым проколом крови. Несмотря на низкое количество этих клеток в образце крови, мы первыми установили несколько циркулирующих опухолевых клеточных линий из крови пациента с большей озабоченностью, используя 3D-контролируемое состояние.
Эта клеточная линия может быть использована на любой коммерческой клеточной линии для рутинного эксперимента. Например, для генетического скрининга лекарств, для белка, представляющего интерес, а также для эксперимента in vivo, чтобы проверить способность опухоли к инициации и их метастатический потенциал. CTC, циркулирующие линии опухолевых клеток, следует культивировать в 3D условиях при гипоксии.
После того, как СТС сформировал сферы, мы можем поместить его в среду и центрифугировать его в течение пяти минут при 300 RCF. Откажитесь от супернатанта и добавьте 500 микролитров Accumax. Подвешиваем один и инкубируем раствор 20 минут при 37 градусах.
Затем промыть диссоциированные сферы PBS и гранулировать клетки. Повторно суспендируйте гранулу со свежедополненным DMEM/F12 и посмотрите на ячейки плотностью пять ячеек на микролитр в новой пластине 24 Low Attachment. Сферы центрифужных ЦОК устраняют супернатант и дважды промывают гранулу PBS.
При 500 микролитрах PFE хорошо перемешать и высиживать трубку на льду в течение 20 минут. Затем центрифугируйте неподвижные сферы и дважды промывайте гранулу PBS, устраняя максимальный объем PBS и добавляя 20 микролитров сформированного HistoGel. Возьмите его в суспензию и сделайте каплю на вазе для культуры, дайте высохнуть в течение 10 минут и отсоедините с помощью скальпеля.
Теперь вы можете обработать любой желаемый, чтобы CTC нацеливались на желаемый интересующий белок. Соберите CTC и отсоедините сферы с Accumax, как описано ранее. Исключите Accumax и повторно суспендируйте гранулу тремя мл блокирующего буфера и передайте суспензию через 14-микрометровый клеточный сетчатый фильтр для получения одноклеточного раствора.
Подсчитайте ячейки и отправьте в трубки и добавьте объем 200 000 ячеек, центрифугируйте трубки и выбросьте супернатант. Согласно техническому описанию антител, добавьте в пробирку желаемый объем антитела и в другую пробирку его изотип и продолжайте этапы в соответствии с указаниями производителя. Оставшаяся трубка не будет маркирована, и в этом эксперименте настоятельно рекомендуется использовать рынок жизнеспособности.
На цитометре начните с немаркированной трубки, чтобы установить напряжение в отрицательно маркированной области. После этого поместите изотип трубки. Изотип будет служить отрицательным элементом управления для различения положительного сигнала и неспецифического сигнала.
И закончите эксперимент с мечеными клетками с интересующим антителом, где вы должны увидеть сдвиг в положительно меченых воротах, если экспрессируется интересующий белок. Это приостанавливает диссоциированные ЦОК в дополненной среде при плотности 200 000 клеток на мл. В ultra Low насадка 96, пластина колодца, запечатывает объем 50 микролитр и инкубирует пластину 24 часа в гипоксии.
На следующий день добавляют 50 микролитров различной концентрации испытуемого препарата и добавляют тот же объем DMEM/F12 только для дальнейшего определения основания клеточной жизнеспособности и инкубируют пластину еще 48 часов. На третий день восстановите средство и добавьте 70 микролитров смеси в каждую лунку. Поместите пластину на орбитальный шейкер на 20 минут, а затем измерьте люминесценцию.
Этот анализ является полезным инструментом для тестирования большого количества лекарств, чтобы оценить их влияние на рост клеток CTC. В Эппендорфе повторное суспендирование клеток в 100 микролитрах PBS зажимает кожу на задней части мыши и вводит иглу под кожу. Медленно вводили весь объем в одно и то же место и контролировали рост опухоли каждый второй день и приносили в жертву мышей, если опухоль превышала размер 1,5 кубических сантиметров.
Перед операцией введите подкожно болеутоляющее средство, на дорсальной вентральной стороне мыши сделайте небольшой разрез ниже 10-го ребра. Осторожно выньте селезенку и выложите ее на стерильную марлю. Используя инсулиновый шприц, введите 50 микролитров повторно суспендированных ЦОК в PBS и подождите три минуты, не удаляя иглу.
Облизывание артериального сосуда с одной стороны и продажного сосуда с другой стороны. Затем удалите селезенку, разрезав непосредственно над двумя лигатурами. Сшить брюшную брюшину и кожу и хорошо продезинфицировать область.
Целью этого эксперимента является проверка способности CTC, полученных из колоректального рака пациента, колонизировать печень путем индуцирования видимого метастатического предвидения. Выделение и установление линии опухолевых клеток клиники является новым инструментом как для фундаментальных, так и для трансляционных исследований. Например, если у вас есть ген, представляющий интерес, где исследования in vivo показали, что этот ген участвует в миграции и инвазионной способности клеточных линий колоректального рака, выбивание этого гена в циркулирующих линиях опухолевых клеток до инъекции в селезенку мышей, чтобы позволить им колонизировать печень, может быть хорошим инструментом для подтверждения вашего результата in vivo.
Для трансляционных исследований наша основная перспектива выделения циркулирующих линий опухолевых клеток заключается в использовании этого драгоценного материала в персонализированной медицине. Из образцов крови пациента мы изолировали и амплировали ЦОК в культуре в течение двух или трех недель, чтобы иметь достаточно материала для скрининга панели доступных лекарств и оценки ее цитотоксичности, чтобы, наконец, приписать
