الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان. تحدث هذه الظاهرة عندما تنفصل الخلايا السرطانية عن الورم الأساسي ، وتذهب إلى الدورة الدموية للوصول في النهاية إلى عضو مستهدف بعيد. بمجرد أن تدخل هذه الخلايا المنفصلة إلى الدم، نسميها خلايا الورم الثانوية.
وهي تمثل مادة متغيرة لأنها من ناحية ، هي الجاني الرئيسي لتشكيل الانبثاث ومن ناحية أخرى ، فهي أسهل من خزعات الورم. في الواقع، يمكن جمعها عن طريق ثقب دم بسيط. على الرغم من انخفاض عدد هذه الخلايا في عينة الدم، ونحن أول من إنشاء العديد من خط الخلايا السرطانية المتداولة من دم المريض مع مزيد من القلق باستخدام حالة 3D التي تسيطر عليها.
يمكن استخدام خط الخلية هذا في أي خط خلية تجارية للتجربة الروتينية. على سبيل المثال، لفحص الأدوية الوراثية، إلى البروتين من الفائدة، ولكن أيضا لتجربة في الجسم الحي لاختبار قدرة بدء الورم وإمكاناتها النقيلي. CTC, تعميم خطوط الخلايا السرطانية, وينبغي أن تكون مثقفة في ظروف 3D في نقص الأكسيجة.
وبمجرد أن تشكل لجنة مكافحة الإرهاب مجالات، يمكننا وضعها في الأجهزة المتوسطة والطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 300 إطار التعاون الإقليمي. تجاهل supernatant وإضافة 500 ميكرولتر من Accumax. نعلق واحدة ونحتضن الحل 20 دقيقة عند 37 درجة.
ثم يغسل المجالات المفككة مع برنامج تلفزيوني والكريهات الخلايا. Resuspend بيليه مع DMEM/F12 تكملها حديثا ونرى الخلايا في كثافة خمس خلايا لكل ميكرولتر في لوحة جديدة 24 مرفق منخفض. أجهزة الطرد المركزي CTCs المجالات القضاء على supernatant وغسل بيليه مرتين مع برنامج تلفزيوني.
في 500 ميكرولتر من PFE مزيج جيدا واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة. ثم، الطرد المركزي المجالات الثابتة وغسل بيليه مرتين مع برنامج تلفزيوني، والقضاء على الحد الأقصى لحجم برنامج تلفزيوني وإضافة 20 ميكرولتر من HistoGel شكلت. أعتبر لتعليق وجعل قطرة على المزهرية الثقافة، والسماح لها الجافة لمدة 10 دقائق وفصله باستخدام مشرط.
يمكنك الآن معالجة لأي المطلوب من أجل CTCs استهداف البروتين المطلوب من الفائدة. جمع CTCs وتفكيك المجالات مع Accumax كما هو موضح سابقا. القضاء على Accumax وإعادة إنفاق بيليه مع ثلاثة مل من العازلة حجب ونقل التعليق من خلال مصفاة الخلية 14 ميكرومتر للحصول على حل خلية واحدة.
عد الخلايا وإرسالها إلى أنابيب وإضافة حجم 200،000 الخلايا، والطرد المركزي الأنابيب والتخلص من supernatant. وفقا لصحيفة بيانات الأجسام المضادة، إضافة في أنبوب، والحجم المطلوب من الأجسام المضادة وفي أنبوب آخر isotype لها ومواصلة الخطوات التالية توجيهات الشركة المصنعة. لن يتم وضع علامة على الأنبوب المتبقي ويقترح بقوة استخدام سوق البقاء في هذه التجربة.
على مقياس الخلايا، ابدأ بالأنبوب غير المسمى لضبط الجهد في المنطقة المسماة سلبا. بعد ذلك، ضع أنبوب isotype. وسيكون النمط الأيزوتيبي بمثابة عنصر تحكم سلبي للتمييز بين الإشارة الإيجابية والإشارة غير المحددة.
والانتهاء من التجربة مع الخلايا المسماة مع الأجسام المضادة ذات الاهتمام حيث يجب أن نرى تحولا في بوابة المسمى إيجابيا، إذا تم التعبير عن البروتين من الفائدة. هذا تعليق CTCs فصل في المتوسطة المكملة في كثافة 200, 000 خلية لكل مل. في مرفق منخفض جدا 96، لوحة جيدا، ختم حجم 50 ميكرولتر واحتضان لوحة 24 ساعة في نقص الأكxia.
في اليوم التالي، إضافة 50 ميكرولتر من تركيز مختلف من المخدرات اختبار وإضافة نفس الحجم من DMEM/F12 فقط لمزيد من تحديد قاعدة الجدوى الخلوية واحتضان لوحة لمدة 48 ساعة أخرى. في اليوم الثالث، إعادة تشكيل وكيل وإضافة 70 ميكرولتر من هذا المزيج في كل بئر. وضع لوحة على شاكر المداري لمدة 20 دقيقة ومن ثم قياس التلألؤ.
هذا المقايسة هي أداة مفيدة لاختبار عدد كبير من الأدوية من أجل تقييم آثارها على نمو خلايا لجنة مكافحة الإرهاب. في Eppendorf، إعادة ضغط الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قرصة الجلد على الجزء الخلفي من الماوس وإدراج الإبرة تحت الجلد. حقن ببطء حجم كامل في نفس المكان ورصد نمو الورم كل يوم الثاني وضحى الفئران إذا تجاوز حجم الورم 1.5 سم مكعب.
قبل الجراحة، قم بحقن مسكن للألم تحت الجلد، في الجانب البطني الظهري من الفأر، قم بعمل شق صغير تحت الضلع العاشر. ارفع الطحال برفق وضع على شاش معقم. باستخدام حقنة الأنسولين، قم بحقن 50 ميكرولتر من CTCs التي أعيد إنفاقها في PBS وانتظر لمدة ثلاث دقائق دون إزالة الإبرة.
Ligate الأوعية الشريانية من جانب واحد ووعاء الوريد من الجانب الآخر. ثم إزالة الطحال عن طريق قطع مباشرة فوق اثنين من الأربطة. غرزة في الصفاق البطن والجلد وتطهير المنطقة جيدا.
الهدف من هذه التجربة هو اختبار قدرة CTCs المستمدة من مريض سرطان القولون والمستقيم لاستعمار الكبد عن طريق تحفيز، بعد النظر النقيلي مرئية. عزل وإنشاء خط الخلايا السرطانية العيادة هو أداة ناشئة لكل من الدراسات الأساسية والترجمة. على سبيل المثال، إذا كان لديك جين من الاهتمام حيث أظهرت الدراسات في الجسم الحي أن هذا الجين يشارك في الهجرة والقدرة على غزو خطوط الخلايا السرطانية القولون والمستقيم، وضرب هذا الجين في تعميم خطوط الخلايا السرطانية قبل الحقن في طحال الفئران، للسماح لهم استعمار الكبد قد يكون أداة جيدة لتأكيد النتيجة الخاصة بك في الجسم الحي.
بالنسبة للدراسات التحويلية ، فإن منظورنا الرئيسي لعزل خطوط الخلايا السرطانية المتداولة هو استخدام هذه المادة الثمينة في الطب الشخصي. من عينات دم المريض ، فإننا عزل وتضخيم CTCs في الثقافة لمدة أسبوعين أو ثلاثة أسابيع من أجل الحصول على ما يكفي من المواد لفحص لوحة من الأدوية التي تتوفر وتقييم السمية الخلوية لعزو أخيرا
