Le marquage unicellulaire et la visualisation des tonnelles dendritiques ou axonales sont nécessaires pour étudier la morphogenèse neuronale. En marquant les tonnelles en développement d’une manière peu invasive, le tissu rétinien reste sain et convient à l’imagerie confocale prolongée en direct. Le principal avantage de cette méthode est la possibilité de visualiser des tonnelles individuelles avec des protéines fluorescentes multicolores dans les quatre jours suivant l’injection.
Cela rend possible l’étude des morphologies des tonnelles néonatales. Ce protocole d’imagerie et d’analyse par injection peut être utilisé pour étudier les morphologies neuronales dans le système nerveux central. Le lieu approprié de sélection et d’injection du Cre doit être déterminé pour cibler la population cellulaire d’intérêt.
Commencez par sélectionner une ligne de souris Cre pour étiqueter les populations de cellules rétiniennes d’intérêt. Obtenir le virus AAV dépendant de la recombinase codant pour des protéines fluorescentes. Pour un marquage optimal des processus fins, sélectionnez des vecteurs qui expriment des protéines fluorescentes modifiées ciblant la membrane plasmique.
Pour l’aliquote AAV sur glace, et préparez une dilution AAV d’un à quatre à l’aide d’une solution saline stérile ou pbS. Pour visualiser les injections, colorez la solution en bleu en ajoutant environ un microlitre de solution de colorant FCF Fast Green à 0,02% pour chaque 15 microlitres de dilution AAV. Stériliser la zone d’injection avec de l’éthanol à 70%.
Remblayer la micropipette avec la dilution AAV à l’aide d’un microsyringe. Sous un stéréomicroscope, cassez la pointe de la micropipette avec une aiguille de calibre 30 pour desceller la pointe. Après avoir anesthésié les souris néonatales, tatouez leurs coussinets avec de l’encre de tatouage à l’aide d’une aiguille de calibre 30 pour identifier les animaux.
Recueillir des coupures de queue pour l’isolement de l’ADN et le génotypage. Écouvillonnez la peau recouvrant les yeux avec de l’éthanol à 70%. Utilisez une aiguille de calibre 30 pour ouvrir la paupière fusionnée tout en appliquant une légère pression avec les doigts pour ouvrir l’œil.
Percer un petit trou dans la cornée à la jonction de la sclérotique cornéenne. Insérez la micropipette en verre dans le trou et appuyez deux à quatre fois sur la pédale du micro-injecteur pour injecter l’AAV dans l’espace intravitréen. Retirez lentement la micropipette et confirmez l’injection d’AAV en visualisant le colorant bleu dans la pupille.
Après avoir préparé l’aCSF rétinien comme décrit dans le manuscrit du texte, oxygénez l’aCSF rétinien en bouillonnant avec du carbogène pendant au moins 15 minutes, puis ajustez le pH à 7,4. Incorporez une boîte de Petri de 60 millimètres de diamètre dans un bac à glace et remplissez-la d’aCSF rétinien oxygéné. Placez la boîte de Petri remplie sous un stéréomicroscope.
Ensuite, coupez le rabat de paupière de la souris euthanasiée pour exposer l’œil. Utilisez des pinces contondantes pour énucléer les yeux et les transférer dans le CSAf rétinien froid placé sous le stéréomicroscope. Sous le stéréomicroscope, stabiliser l’œil en serrant le nerf optique à l’aide de la pince Numéro cinq de Dumont et percer un trou au centre de la cornée avec une aiguille de calibre 30, puis insérer une pointe des micro-ciseaux dans le trou pour faire une incision du trou à l’extrémité de la cornée.
Répétez l’opération pour faire quatre tranches dans les directions cardinales, en créant quatre rabats. Saisissez et séparez les deux lambeaux adjacents, en pelant doucement la sclérotique de la rétine pour tous les lambeaux de cornée. Retirez ensuite le cristallin de la coupe rétinienne à l’aide de la pince.
Enfin, utilisez des micro-ciseaux pour faire quatre incisions radiales du bord de la rétine vers le nerf optique, créant quatre pétales égaux. Si vous utilisez des filtres à membrane MCE gris de grand diamètre pour le montage, coupez le disque en quadrants d’environ un centimètre de diamètre, puis placez le disque MCE au centre d’un papier filtre blanc plus grand. À l’aide de deux pinceaux de taille trois par zéro, retournez une tasse rétinienne sur un pinceau avec la cellule ganglionnaire rétinienne vers le bas.
Soulevez doucement la rétine hors de l’aCSF, en vous assurant que la tension de l’eau ne déchire pas la rétine. Tout en tenant toujours le pinceau avec la rétine, déplacez la boîte de Petri contenant de l’aCSF et placez le papier filtre blanc avec la membrane MCE sous le stéréoscope. À l’aide d’une pipette de transfert, placez une gouttelette d’aCSF au centre du papier filtre MCE.
Faites flotter la rétine dans la gouttelette d’aCSF créée par la tension superficielle et la membrane MCE chargée. Utilisez des pinceaux pour positionner la rétine dans la gouttelette avec la cellule ganglionnaire rétinienne vers le haut, puis dépliez les quatre pétales. Une fois positionné, créez un pont d’eau entre le pinceau et le papier filtre blanc pour briser la tension superficielle de la gouttelette.
Assemblez la chambre d’incubation d’imagerie en direct et remplissez-la d’aCSF oxygéné. Allumez la pompe et le régulateur de température, en vous assurant que la température ne dépasse pas 34 degrés Celsius. Il peut s’écouler jusqu’à une heure avant que la température de la chambre ne se stabilise.
Il est recommandé de mettre en place la chambre d’incubation avant de commencer la dissection rétinienne. La température stable de la chambre aide à réduire la dérive de l’échantillon. Pour transférer le monticule plat rétinien dans la chambre de perfusion, arrêtez la pompe et retirez le CSPa qui se trouve dans la chambre.
Placez ensuite le disque MCE avec le support plat rétinien dans la chambre d’incubation. Pré-mouillez un poids d’échantillon pour briser la tension superficielle, puis placez-le sur le support plat en vous assurant que le poids de l’échantillon est placé sur le papier MCE pour réduire la dérive de l’échantillon. Remplissez la chambre avec l’aCSF réchauffé et faites circuler l’aCSF à environ un millilitre par minute.
Positionnez le nez avec l’objectif de trempage d’eau 25 fois dans la chambre d’imagerie. Filtrez les cellules marquées d’intérêt à l’aide d’une lumière épifluorescente et ajustez le volume d’imagerie pour capturer les caractéristiques dendritiques d’intérêt. À l’aide d’une table de choix qui identifie à la fois les pixels sursaturés et sous-saturés, ajustez la puissance du laser de manière à ce qu’aucun pixel ne soit sursaturé.
Acquérez le volume d’imagerie 3D et répétez l’acquisition à la fréquence d’images souhaitée. Le volume d’imagerie peut être ajusté entre chaque point temporel pour compenser la dérive de l’échantillon. Importez la série d’images en divisant les images en fonction du temps.
Enregistrez tous les points de temps manuellement ou en exécutant un plugin de macro. Créez une fonction théorique d’étalement de points à l’aide du plug-in ImageJ en cliquant sur Défenaction PSF 3D, l’ouverture numérique de l’objectif, la longueur d’onde d’émission de fluorophore, la taille des pixels et l’espacement Z sont nécessaires pour créer un PSF précis. Sélectionnez des plugins, des macros et exécutez pour effectuer une déconvolution itérative parallèle par lots pour tous les points temporels à l’aide de la macro fournie.
Importez tous les points temporels déconcentrés en tant que pile en cliquant sur fichier, importer, puis séquence d’images. Convertissez la pile en hyperstack en cliquant sur image, hyperstacks, puis piles en hyperstack. Ajoutez le nombre de tranches Z et de périodes, puis corrigez la dérive 3D à l’aide du plugin de dérive 3D approprié.
Enregistrez l’hyperstack corrigée de la dérive 3D et reconvertissez l’image en une pile normale en cliquant sur image, hyperstacks, hyperstack à empiler, puis divisez les points temporels en cliquant sur image, piles, outils et séparateur de piles. Pour connaître le nombre de sous-piles à fractionner, entrez le nombre de points temporels. Utilisez le traitement par lots pour créer une projection maximale pour tous les points temporels.
Importez la séquence d’images en accéléré en cliquant sur fichier, importer, puis séquence d’images. Et utilisez les outils ImageJ conventionnels pour l’analyse souhaitée de la vidéo bidimensionnelle déconcentrée et post-traitée, Une vidéo 3D haute résolution de dendrites de cellules de sursaut d’étoiles en développement a été acquise, déconvolvée et corrigée pour la dérive 3D. Des projections maximales du plan Z ont été produites pour réaliser des vidéos 2D à des fins d’analyse, montrant une zone de raffinement dendritique et une zone de croissance dendritique.
La déconvolution 3D de chaque point temporel a augmenté la résolution des projections de filopodes fins de cellule amacrine à sursaut d’étoile P6 unique avant et après la déconvolution avec ImageJ. Les périodes prolongées d’infection à AAV n’entraînent pas nécessairement une augmentation du signal fluorescent, comme le montrent des niveaux similaires d’expression des protéines cinq et 11 jours après l’injection. Il est important de réduire la dérive de l’échantillon pendant l’imagerie.
La dérive est minimisée en maintenant une température d’imagerie constante et en positionnant correctement le poids sur l’échantillon. En cas de dérive, l’acquisition manuelle de la série chronologique permet d’ajuster le volume d’imagerie entre les images. Cela garantit que les caractéristiques d’intérêt restent dans le cadre.
Ce protocole produit des vidéos 3D haute résolution, déconcentrées et corrigées de la dérive de neurites en développement. De telles vidéos permettent de mieux comprendre le câblage des neurones et sont nécessaires pour faire progresser les méthodes d’analyse informatique de la morphogenèse 3D. De meilleurs logiciels de traçage et de suivi automatiques sont nécessaires pour réaliser une analyse à haut débit du développement de neurites.
