Цифровая капельная ПЦР обеспечивает повышенную точность и чувствительность по сравнению с количественной ПЦР. Это простой метод цифровой капельной ПЦР, требующий минимального оборудования и отсутствия опыта. Шаблонная эмульгация частиц представляет собой метод эмульгирования без микрофлюидности, который не требует какого-либо специализированного оборудования.
Кроме того, эмульгирование происходит в течение нескольких секунд и масштабируется до объема контейнера. Для коммерческих шариков добавьте 0,5 грамма высушенных полиакриламидных частиц, совместимых с эмульгированием шаблона частиц или PTE, к 30 миллилитрам стерильной воды в 50-миллилитровой конической трубке и хорошо перемешайте. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.
Для микрофлюидного изготовления бусин налейте один миллилитр фоторезиста на центр трехдюймовой кремниевой пластины, а затем вращайте его при 500 оборотах в минуту в течение 30 секунд, а затем 1250 об/мин в течение 30 секунд. Поместите пластину на конфорку, установленную на 95 градусов Цельсия, на 15 минут, чтобы испарить растворитель. Закрепите фотомаску на кремниевой пластине с помощью стеклянного затвора и обнажите пластину под коллимированным УФ-светодиодом в течение 2,5 минут.
Поместите на конфорку, установленную на 95 градусов Цельсия, в течение пяти минут для выпечки после экспозиции. Разработайте фоторезистическую кремниевую пластину, погрузив ее в ванну с 100% PGMEA на срок до 15 минут. Промыть пластину свежим 100% PGMEA, а затем 100% изопропанолом.
Высушите пластину на воздухе, затем высушите ее на конфорке, установленной на 95 градусов цельсия в течение одной минуты, и поместите ее в чистую трехдюймовую чашку Петри. Смешайте кремниевую основу PDMS и реагент для отверждения в соотношении 10:1, затем дегазируйте смешанную PDMS с помощью осушителя под вакуумом, пока не будут наблюдаться пузырьки воздуха. Вылейте дегазированную PDMS в чашку Петри, убедившись, что кремниевая пластина полностью погружена в воду.
Дегазируйте кремниевую пластину и PDMS, а затем отверждайте PDMS, помещая кремниевую пластину в духовку, установленную на 65 градусов Цельсия в течение не менее 60 минут. Вырежьте блок PDMS, содержащий микрофлюидные признаки, из чашки Петри, используя скальпель. Продувите входные и выходные отверстия в блок PDMS с помощью 0,75-миллиметрового биопсийного перфоратора.
Затем удалите всю пыль и твердые частицы с повторным нанесением и удалением упаковочной ленты на поверхность блока. Очистите стеклянную горку, промыв ее 100% изопропанолом, а затем высушив поверхность на воздухе. Плазма обрабатывает как стеклянный слайд, так и PDMS одним миллибаром кислородной плазмы в течение одной минуты, используя плазменный бондер.
Прикрепите PDMS к стеклянному слайду, поместив обработанную плазмой PDMS с элементами, обращенными вниз, на стеклянную горку, обработанную плазмой сторону вверх. Поместите горку в духовку, установленную на 65 градусов Цельсия, не менее чем на 30 минут, чтобы завершить склеивание. Обработайте все микрофлюидные каналы фторированной обработкой поверхности для обеспечения гидрофобности поверхности, затем выпекайте устройство при 65 градусах Цельсия в течение не менее 10 минут.
Загрузите в шприцы, содержащие раствор, как полиакриламидные, или PAA, так и гидрофторэфирные, или HFE, содержащие шприцы. Подключите оба шприца к микрофлюидному устройству с помощью полиэтиленовой трубки. Запустите устройство генерации капель и соберите один миллилитр капель в 15-миллилитровую сборную трубку, затем инкубируйте в течение трех часов при комнатной температуре для полимеризации.
После инкубации удалите нижний слой масла путем пипетки. Добавьте один миллилитр 20% PFO в HFE масле в 15-миллилитровую коллекторную трубку в качестве химического деэмульгатора. После перемешивания открутите 15-миллилитровую сборную трубку при 2000 х г в течение двух минут.
Снимите нижний слой путем пипетки и повторите процесс еще раз. Добавьте два миллилитра 2%-ного сорбитана моноолеата в гексане в 15-миллилитровую коллекторную трубку и вихрьте ее. Раскрутите трубку при 3000 х г в течение трех минут и удалите супернатант путем пипетки, чтобы удалить раствор поверхностно-активного вещества.
Повторите это дважды. Добавьте пять миллилитров буфера TEBST и хорошо перемешайте, затем раскрутите при 3000 х г в течение трех минут и удалите супернатант путем пипетирования. Повторите это три раза, затем повторно суспендируйте в пяти миллилитрах TEBST.
Подготовьте частицы полиакриламида для эмульгирования частиц путем центрифугирования при 6000 х г в течение одной минуты, чтобы гранулировать частицы. Затем удалите супернатант путем пипетки и повторно суспендируйте гранулу в стерильной воде. Повторите три раза, чтобы обеспечить удаление любого остаточного TEBST.
Подготовьте дисперсную фазу в свежей 15-миллилитровой центрифужной трубке, используя мастер-смесь ПЦР, соответствующие праймеры и гидролизный зонд флуоресцеина, как описано в текстовой рукописи. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут под мягким перемешиванием, используя трубчатый ротатор. Центрифугируйте дисперсную фазу при 6000 х г в течение одной минуты и удалите супернатант.
Добавьте один микролитр геномной ДНК Saccharomyces cerevisiae в гранулу и тщательно перемешайте путем пипетирования или энергичного постукивания. Добавьте 200 микролитров 2%-го фтор-фазанта в HFE-масле в трубку для эмульгирования. Вытесните гранулу путем пипетки или постукивания по трубе, а затем вихрь при 3000 об/мин в течение 30 секунд.
Дайте эмульсиям отстояться в течение одной минуты, затем удалите 100 микролитров нижней масляной фазы и замените этот объем свежим 2%-ным фторповерхностным веществом в масле HFE. Осторожно переверните трубку несколько раз, чтобы перемешать. Повторяйте это три раза или более, пока не будут удалены небольшие спутниковые капли.
После двух-пяти минут отстаивания удалите нижнюю масляную фазу. Замените этот объем 5% фторповерхностным веществом во фторуглеродном масле. Пипетка 100 микролитров образца в 200-микролитровые ПЦР-трубки и поместите ПЦР-трубки в термоциклер.
Пипетка образца на счетный слайд для флуоресцентной визуализации и изображение образца. Эмульгирование частиц обеспечивает превосходную монодисперсность. По мере удаления избытка супернатанта добавляется стабилизирующее поверхностно-активное вещество, и образец вихрь генерируется для получения эмульсии.
Полученные капли состоят из ядра частиц и водного образца, содержащего реагенты и образцы молекул или клеток, необходимых для реакции. Полидисперсные капли с шаблонизирующими частицами указывают на недостаточный вихрь. Другой проблемой является генерация избыточных спутников, которые снижают эффективность инкапсуляции.
Спутники должны составлять не более 10% от общего объема инкапсулированной пробы. Их можно очистить от эмульсии, промыв свежим маслом. Полезность PTE может быть продемонстрирована в цифровой ПЦР, когда капли, содержащие амплифицированные мишени, становятся флуоресцентными, что позволяет проводить прямое количественное определение целей.
Флуоресцентные капли дают мало положительных результатов, когда мишень редка, и много, когда она в изобилии. Эти результаты повторяются с использованием коммерчески доступных полиакриламидных частиц, достигая точных измерений в том же диапазоне. Удаление супернатанта из дисперсной фазы имеет важное значение для инкапсуляции образца.
Знание объема гранулы и супернатанта может помочь определить интерфейс между ними. Когда сомневаетесь, ошибитесь на стороне удаления супернатанта.
