Глиобластомы являются разрушительными опухолями головного мозга с высоким инвазивным профилем. Эта система кокультуры имитирует миграцию клеток глиобластомы на нейроны, чтобы рекапитулировать один из инвазивных путей, наблюдаемых у пациентов. Геометрия и состав нашей модели совместной культуры точно контролируются.
Это способствует лучшей воспроизводимости, а также прямой количественной оценке сложных биологических процессов. Этот метод может быть адаптирован к клинической диагностике путем совместного культивирования свежеиссоциированных клеток и нейронов глиобластомы. Он определяет клинический индекс, который очень важен как клинический результат.
Наш метод также может быть использован для количественной оценки других мигрирующих клеток, таких как фибробласты или иммунные клетки. Продемонстрировать процедуру будет Джорис Гийон, аспирант из моей команды. Чтобы сделать подложку для микроструктурирования, обработайте 18-миллиметровые круглые стеклянные крышки воздушной или плазменной активацией в течение пяти минут, прежде чем поместить крышки в осушитель со 100 микролитрами триэтоксисилана в течение одного часа, затем инкубируют раствор ПЭГ-СВА по 100 миллиграмм на миллилитр в течение одного часа.
Для осаждения геля в конце инкубации добавьте три микролитра PLPP и 50 микролитров абсолютного этанола в центр слайда и подождите, пока он полностью высохнет. Для микроструктурирования стекла установите крышку в камеру Ludin и поместите камеру на сцену микроскопа, оснащенного системой автофокусировки. После создания образа загрузите микроструктурные изображения в программное обеспечение.
После автоматического секвенирования ультрафиолетового излучения используйте пипетку для промывки PLPP с крышки с помощью PBS. Затем инкубируют крышку с 50 микрограммами на миллилитр ламинина в течение 30 минут, а затем еще одну промывку PBS, как показано на демонстрации. Чтобы создать культуру нейронов гиппокампа эмбриональной крысы на микрошагтерных покровах, после последней промывки регидратируют стеклянные горки с помощью культуральной среды нейрональных клеток.
Посейте пять раз от 10 до четвертого нейрона гиппокампа крысы, взвешенных в нейробазальной среде, обогащенной 3% лошадиной сывороткой на квадратный сантиметр, на каждый микрошаблонированный покров для 24-часовой инкубации в инкубаторе 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия. Центрифуга диссоциирует клетки глиобластомы в течение пяти минут при 1000 об/мин и повторно суспендирует гранулу в культурной среде клеток глиобластомы, затем осаждает один раз 10 до третьих клеток GBM над микроструктурированными нейронами. Для визуализации живых клеток поместите кокультуру на сцену инвертированного микроскопа, оснащенного термостатной камерой 37 градусов Цельсия, и выберите объектив 20X.
Затем используйте набор инструментов многомерных приобретений в программном обеспечении микроскопа для получения живых изображений томатов Brightfield и эпифлуоресценции GFP каждые две минуты в течение 12 часов в 16 различных положениях в зависимости от количества паттернов с нейронами. Для анализа нейронной сети после визуализации выберите одно изображение из стека. Щелкните правой кнопкой мыши сетевой инструмент, чтобы открыть соответствующее диалоговое окно параметров и настроить параметры для получения точной сегментации изображений.
Нажмите кнопку ОК. Щелкните левой кнопкой мыши на сетевом инструменте, чтобы продублировать выбранное изображение и разделить изображение на красный, серый и зеленый цветовые каналы. Выберите серый канал и выполните контрастное усиление растяжения, чтобы улучшить разделение между различными областями. Используйте детектор края Собеля для выполнения свертки обработки 2D-сигнала, сгруппированной под командой find edge.
Для двойной фильтрации примените размытие Гаусса и медианный фильтр, чтобы уменьшить шум и сгладить сигнал объекта. Для преобразования в маску выполните адаптированные пороговые алгоритмы для получения двоичного изображения с черно-белыми пикселями. Затем скелетируйте область ячейки в простую сеть и используйте частицы фильтра для удаления небольших несетных частиц в результатах.
Частицы сетевого фильтра в сетевом изображении. Чтобы получить красный и зеленый каналы, выполните двойную фильтрацию и преобразуйте в маску, как показано с использованием адаптированного метода порогового значения. Используйте анализ частиц для определения морфологии клеток в двоичном зеленом изображении.
Используйте оператор or для объединения всех каналов с использованием интересующих их областей и перенастройки их начального цвета в простое RGB-изображение. Чтобы выполнить анализ подвижности одной клетки, щелкните правой кнопкой мыши инструмент отслеживания одной ячейки, чтобы открыть диалоговое окно соответствующих параметров и настроить параметры для получения точной сегментации изображений. Нажмите OK и щелкните левой кнопкой мыши на отслеживании одной ячейки, чтобы удалить серый канал.
Чтобы создать изображение, соответствующее стеку изображений в соответствии со временем, примените Z-проекцию и двойной фильтр и преобразуйте для маскировки следов, оставленных ячейками. Удалите мелкие частицы из двоичного красного и зеленого изображения, как показано на рисунке. Используйте инструмент «Область интереса», чтобы выделить каждый контур трассировки ячейки и установить флажок обнаружения края пропуска в диалоговом окне параметров.
Изолируйте красный канал на исходном стеке и выберите одну интересуюшую область. Дважды отфильтруйте все изображения и преобразуйте в маску, чтобы можно было определить положение центроида XY каждого бинаризированного ядра. Положения XY можно использовать для расчета среднего квадратного смещения, коэффициента направленности и средней скорости ячейки.
Для анализа отслеживания нескольких ячеек щелкните правой кнопкой мыши инструмент отслеживания, чтобы открыть диалоговое окно соответствующих параметров и настроить параметры для получения точной сегментации изображений. Щелкните левой кнопкой мыши на инструменте отслеживания, чтобы удалить серый канал. Разделите красный и зеленый каналы, дважды отфильтруйте и преобразуйте в маску.
Затем используйте команду калькулятора изображений с оператором and, чтобы объединить каналы, оставляя только сигнал ядра, расположенный внутри мембран, и рассчитать график траектории, среднее квадратическое смещение, коэффициент направленности и среднюю скорость для клеток, как показано. Флуоресцентный GBM, культивируемый совместно с узорчатыми нейронами, быстро изменяет свою форму и показывает миграцию вдоль расширений нейронов в случайном движении. Клетки GBM, засеянные на нейроны, имеют вытянутую форму с несколькими выступами, которые следуют за следами нейронов, в то время как клетки сохраняют свою округлую форму при культивировании на ламинине.
На более поздних стадиях культивировать тонкие протрузии, связывающиеся с клетками, могут наблюдаться в нейронных кокультурах GBM. Клетки GBM, засеянные на нейроны, демонстрируют большую миграционную способность, чем клетки GBM, засеянные на ламинин, как это наблюдается на этих участках траектории. Анализ флуоресцентного слияния клеток показывает, что в течение 500-минутного периода наблюдения наблюдается большая миграция клеток, когда сфероиды культивируются совместно с нейронами, чем когда клетки культивируются только на ламинине.
Действительно, к концу анализа почти половина картины покрыта клетками GBM, в то время как сфероиды, культивируемые на ламинине, остаются непривязанными к покрову. В зависимости от биологических вопросов, на которые вы хотите ответить, следует позаботиться о том, чтобы дизайн паттерна, а также плотность клеток были репрезентативными для условий in vivo. Клетки могут быть зафиксированы и визуалированы с помощью конфокальной микроскопии.
Живая визуализация также возможна, поскольку наш метод не ухудшает возможности визуализации. Этот метод хорошо подходит для изучения молекулярного взаимодействия, такого как метаболические обмены между клетками глиобластомы и нейронами. Это позволяет исследовать функцию биологических процессов.
Высокопроизводительный эксперимент также может проводиться в клинических целях.
