Этот протокол облегчает количественный мелко-масштабный анализ содержания липидов клеточного хранения в различных видах дрожжей и делает это непредвзято и стандартизировано. Техника позволяет быстро обрабатывать микроскопические изображения и обеспечивает подробные количественные результаты, чтобы легко сравнить образцы, такие как различные мутанты и клетки, выращенные в различных условиях. Для начала следуйте в сопроводительном текстовом протоколе, чтобы подготовить решения для окрашивания, культурные средства массовой информации и клетки.
Убедитесь, что клетки здоровы и находятся в желаемой фазе роста до запуска эксперимента. Затем подготовьте обложку микроскопа для каждого образца, который будет изображен. Распространение одного микролитров слайд-покрытия раствора на чистый coverslip с помощью длинной стороны горизонтально расположены пипетки отзыв.
Разрешить покрытие раствор полностью высохнуть, а затем хранить крышки в без пыли окружающей среды. Далее, измерить оптическую плотность клеточных культур, и для культур, которые будут проанализированы в той же фазе роста, попытаться достичь аналогичных значений среди всех проверенных культур для обеспечения сопоставимых экспериментальных условий. Затем пипетка один миллилитр клеточной культуры в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Только для клеток S.cerevisiae добавьте в трубку пять микролитров раствора слайд-покрытия. Затем, кратко вихрем все микроцентрифуг трубки, и инкубировать их при 30 градусов по Цельсию с встряхивания в течение пяти минут. Далее добавьте один микролитер раствора липидного окрашивания в каждую культуру aliquot, и вихрь их кратко.
Затем добавьте 10 микролитров раствора визуализации границы ячейки и кратко вихрем во второй раз. Соберите клетки путем центрифугирования их при 1000 раз тяжести в течение трех минут при комнатной температуре. Когда закончите вращаться, удалить 950 микролитров из супернатанта и повторно использовать клетки в оставшихся supernatant с помощью пипетки.
Далее, пипетки два микролитров плотной клеточной подвески на лектин покрытием крышки. Затем поместите крышку на чистый слайд микроскопа, чтобы сформировать монослой клетки, и перейти к микроскопии как можно быстрее, чтобы свести к минимуму артефакты в изображении. Настройка микроскопа требует длительного воздействия сильных источников света, которые могут привести к повреждению образца и искажению результатов.
Таким образом, настроить условия изображения с помощью выделенного слайда образца, который не будет использоваться для количественной оценки липидных капель. Поместите выделенный образец на стадию установки контрастного или дифференциального интерференционного микроскопа и сосредоточьтесь на клетках. В программном обеспечении микроскопа установите настройки стека, чтобы они охватывают весь объем ячейки.
Общее вертикальное расстояние зависит от размера ячейки, а количество оптических срезов зависит от численного отверстия цели. Затем установите фокус для перемещения по отношению к центральной фокусной плоскости. Для изображения липидных капель, экспериментально установить интенсивность света и время экспозиции в зеленом канале.
Будьте осторожны при визуализации, так как BODIPY является очень ярким флюорохромом, который может быть быстро фотоотвеч. Кроме того, свести к минимуму время экспозиции, чтобы избежать перенасыщения. Захват полного зеленого канала - стек, прежде чем перейти на синий канал, чтобы предотвратить размытие мобильных липидных капель.
Для границ клеток изображения экспериментально установите интенсивность света и время экспозиции в синем канале. По возможности на настройку и использование автоматизированного экспериментального рабочего процесса в программном обеспечении для управления микроскопом для облегчения визуализации нескольких образцов в стандартизированных условиях. Важно отметить, что все изображения должны быть получены с использованием тех же параметров, чтобы обеспечить надлежащее сравнение между образцами.
После оптимизации условий визуализации сосредоточьтесь на клетках и изумите их как в зеленых, так и в синих каналах. Изображение нескольких полей зрения на выборку для получения надежных репрезентативных данных. Сохранить синий и зеленый канал - стек изображения, как 16-битный, многослойный TIFF файлов.
Обязательно включите слова зеленый или синий в соответствующие имена файлов. Откройте микроскопические изображения в ImageJ и удалите все стеки изображений, содержащие значительное количество ячеек, которые перемещались во время приобретения. Они отображаются на разных позициях в отдельных разделах.
Затем удалите все стеки изображений, содержащие высокофлуоресцентные неклеточные частицы в синем канале. Это часто вызвано грязью на поверхности изображения или примесями в среде культивирования и может помешать обнаружению клеток в их окрестностях. Кроме того, удалите все стеки изображений, содержащие большую часть мертвых ячеек.
На этих изображениях будут отображаться клетки с повышенной синей флуоресценцией по сравнению с живыми клетками. Хотя наличие нескольких мертвых клеток в образце, как правило, не является проблемой, и эти клетки автоматически отбрасываются во время анализа, некоторые мертвые или умирающие клетки иногда могут быть признаны живыми клетками алгоритмом сегментации и, таким образом, исказить результаты. Чтобы начать анализ в MATLAB, сначала создайте основную папку и скопировать все скрипты MATLAB в это место.
Затем создайте субфолдеры с названиями различных видов дрожжей и скопируйте соответствующие изображения TIFF в этих местах. Теперь начните MATLAB, откройте скрипт MAIN. м, и запустить сценарий.
В меню выберите вид дрожжей для анализа и начните обработку изображений. Проверка и обработка выходных файлов по мере необходимости с помощью редактора электронной таблицы или статистического пакета. Рабочий процесс производит полуколонированные файлы CSV и сегментированные файлы TIFF с обнаруженными клеточными объектами и липидными каплями.
Здесь показаны клетки дикого типа S.pombe, выращенные либо в сложной среде YES, либо в определенной среде EMM. По сравнению с клетками, выращенными в среде YES, в среде EMM было обнаружено меньше липидных капель и более высокая интенсивность окрашивания на единицу объема клеток. Кроме того, отдельные липидные капли, образуюющиеся в среде ЭММ, были крупнее и демонстрировали повышенную общую интенсивность окрашивания.
Это в согласии с предыдущими выводами увеличения содержания липидов в клетках, выращенных в ЭММ. Далее на этих снимках показаны клетки S.japonicus из экспоненциальных и ранних стационарных культур, выращенных в среде YES. Клетки, поступающие в стационарную фазу, показали заметное снижение количества липидных капель на единицу объема клеток, в то время как нормализоваемая интенсивность липидной капли флуоресценции несколько снизилась между двумя условиями.
Ранние стационарные фазы липидных капель, как правило, умеренно больше по размеру и умеренно выше общая интенсивность флуоресценции по сравнению с каплями из экспоненциально растущих клеток. В S.cerevisiae клетки выросли до экспоненциальной по сравнению со стационарной фазы, стационарные клетки содержали несколько меньше липидных капель на единицу объема по сравнению с экспоненциально растущих клеток. Тем не менее, их объем нормализованных капель флуоресценции интенсивность почти в два раза.
Это резкое увеличение общего содержания липидных капель было связано с гораздо более высокой интенсивностью флуоресценции и объемом отдельных липидных капель в стационарной фазе. Следуя этой процедуре, выходные данные могут быть агрегированы в статистическом пакете, таком как R, для создания участков обобщенных результатов и проведения статистических тестов на любые наблюдаемые различия в содержании липидных капель. В принципе, конвейер обработки изображений может быть использован для анализа содержания липидных капель в других микроорганизмах или для анализа других точечных субклеточных структур.
