Здесь мы демонстрируем метод Updegraff, наиболее широко используемый в мире метод оценки кристаллического содержания целлюлозы. Целлюлоза в основном состоит из мономеров глюкозы, связанных бета-1, 4 гликозидных связей. Мы разделили этот протокол на пять этапов.
На первом этапе мы готовим материал из биомассы растения. На втором этапе мы извлекаем сырую клеточной стенки. На третьем этапе мы используем лечение Updegraff, в котором Updegraff состоит из уксусной кислоты и азотной кислоты, которая помогает в удалении гемичеллозы и лигнина из наших образцов.
На четвертой фазе мы подвергаем его кислотный гидролиз с помощью серной кислоты, которая производит мономеры глюкозы. Наконец, на пятом этапе мы используем анализ антрона для оценки кристаллического содержания целлюлозы. Соберите растительный материал из теплицы, тщательно промойте их водой, высушите воздух в течение двух дней, разделите ткань и перенесите ткань в индивидуально маркированную тару и инкубировать в инкубаторе при 49 градусах по Цельсию в течение 10 дней.
Затем, наконец, разрезать на куски с помощью ножниц или лезвия. Заморозить ткани и нагрузки в раствор и пестик для тонкой шлифовки в единый порошок или же использовать морозильник / мельница. Здесь мы демонстрируем использование морозильника / мельницы, поэтому мы загружаем наши образцы тканей в эти шлифовальные флаконы и поставить их в морозильной камере / мельницы и запустить 10 CP скорость в течение трех циклов.
Порошок ткани собирается в трубке Falcon, как показано здесь. Взвесь 20 мг порошка ткани и перенесите в предварительно взвешенную трубку из двух мл. Добавьте один мл буфера солюбилизации белка для удаления белков. вихрь.
Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Отбросьте супернатант. Повторите этот шаг еще два раза.
Добавьте одну мл стерильной воды в сохраненную гранулу. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Повторите этот шаг еще два раза.
Добавьте один МЛ 70% этанола в сохраненные гранулы. вихрь. Передача в разогретый 70 градусов по Цельсию блок с одновременным встряхивания в течение одного часа. После часовой инкубации центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут.
Повторите этот шаг еще раз. К сохраненной грануле добавьте один мл 100%-метилона. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут.
Добавьте один мл хлороформа метанола. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте один мл ацетона. вихрь.
Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Повторно отбросьте супернатант и высушите их при 37 градусах по Цельсию на ночь или продолжайте вакуумную сушку.
Загрузите образцы в вакуумную сушилку и высушите воздух в течение двух-трех часов или до тех пор, пока гранулы полностью высохнут. Взвесь пять мг экстракта клеточной стенки, полученного с предыдущего шага. Передача в две трубки крышки винта МЛ.
Также включите положительный контроль на данный момент. Используйте два мг фильтровальной бумаги Whatman для этой цели. Переход на две трубки крышки винта МЛ.
Добавьте 1,5 мл реагента Updegraff к каждому взвешенной экстракту клеточной стенки. Вихрь и инкубировать при 100 градусах по Цельсию в разогретом блоке в течение 30 минут. Через 30 минут инкубации перенесите на стойку.
Дайте ему остыть на скамейке в течение 10 минут. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта, не нарушая гранулы.
Добавьте один мл стерильной воды. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Отбросьте 500 микролитров супернатанта.
Добавьте один мл ацетона. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Отбросьте один мл супернатанта.
Добавьте один мл ацетона. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Отбросьте супернатант полностью.
Добавьте один мл ацетона. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Отбросьте супернатант.
Высушите при 37 градусах по Цельсию на ночь. После ночной инкубации перенесите на стойку. Добавьте один мл 67%серной кислоты. вихрь.
Инкубировать при 25 градусах по Цельсию в течение одного часа с одновременным встряхивания. После часовой инкубации убедитесь, что гранулы полностью растворяются. Перенесите на стойку.
Это последний шаг экстракции целлюлозы. Теперь образцы готовы к разбавлению образца. Для разбавления образца используйте 10 микролитров каждого образца предыдущего шага и добавьте 490 микролитров стерильной воды.
Повторите это для всех экспериментальных образцов. Для стандартного препарата кривой глюкозы приготовьте свежий запас в один мг на мЛ глюкозы и приготовьте ноль микрограммов до 200 микрограммов концентрации, добавив одну мг на глюкозу мл в 20 микролитровых приращениях и составить окончательный объем до одного мл со стерильной водой. Возьмите 500 микролитров каждого подготовленного стандарта в винтовой крышке трубки и добавьте один мл 0,2% антрона.
И теперь образцы готовы к анализу. Добавьте один мл свежеприготовленного антрона. Смешайте сразу же вихрем и перенесите на лед.
Повторите для всех стандартов и образцов таким же образом. Затем перенесите в разогретый 100 градусов по Цельсию блок в течение 10 минут. Через 10 минут инкубации перенесите на лед и инкубировать в течение пяти минут на льду.
После инкубации возьмите 200 микролитров каждого образца в трех репликациях. Повторите как для стандартов, так и для образцов одинаково. А загруженная пластина из 96 колодец была загружена в мультимодный детектор.
Используя программу Smart Max Pro, мы устанавливаем настройку фильтра до 620 нанометров. Тип плиты до 96-наилучшим образом типа. Выберите всю область чтения.
Нажмите OK. читать. Прочитайте тарелку. Вы получаете показания абсорбанса как стандартов, так и образцов, которые будут собраны в листе Excel для дальнейшего анализа и оценки содержания целлюлозы.
Стандартная кривая глюкозы готовится с помощью концентраций глюкозы в микрограммах на мл на х-оси и нормализованных значений поглощения соответствующей концентрации на уровне 620 нанометров на оси. Мы получаем линию регрессии с значениями m и c в графике рассеяния, который мы используем для оценки кристаллического содержания целлюлозы образца. На первом этапе мы усреднили значения OD на уровне 620 нанометров.
А потом мы нормализовали данные, вычитая пустое значение. Мы вычисляем концентрацию глюкозы по формуле x равна OD минус c/m, где мы подключаем значения c и m от предыдущего шага линии регрессии в стандартной кривой. Так как общий объем, который был использован для анализа антрона составляет 500 микролитров, мы делим его на фактор разбавления два.
Так как объем выборки, который был использован было только 10 микролитров, мы будем далее разделить на 10, чтобы получить микрограмм на микролитер концентрации глюкозы, которая равна мг на мЛ концентрации. И тогда мы использовали фактор влаги 1.11, который является увеличение влаги в этом процессе. И, наконец, мы вычисляем процентное содержание кристаллической целлюлозы, разделив ее с весом клеточной стенки, которая близка к пяти мг, и умножаемся на 100, чтобы получить процент.
Затем мы усредили содержание кристаллической целлюлозы в трех биологических репликациях, чтобы получить значение для отдельных образцов, которое будет сравниться с другой экспериментальной линией в среднем из трех биологических репликаций. И t-test можно использовать для того чтобы испытать их уровень значения. Здесь, в таблице А, мы показываем значения таблицы концентрации и соответствующих OD на 620 нанометров, который был далее использован для построения графика рассеяния и регрессионные линии с значениями m и c, которые использовались в C для получения различий в содержании целлюлозы между двумя экспериментальными линиями.
В заключение, оба образца показывают различия целлюлозы. Спасибо за просмотр.
