هنا، ونحن نظهر طريقة Updegraff، الطريقة الأكثر استخداما في العالم لتقدير محتوى السليلوز البلورية. يتكون السليلوز أساسا من مونومرات الجلوكوز المرتبطة بيتا-1، 4 السندات الجليكوسيدية. قسمنا هذا البروتوكول إلى خمس مراحل.
في المرحلة الأولى، ونحن إعداد المواد الكتلة الحيوية النباتية. في المرحلة الثانية، نستخرج جدار الخلية الخام. في المرحلة الثالثة، نستخدم علاج Updegraff الذي يتكون فيه Updegraff من حمض الخليك وحمض النيتريك الذي يساعد في إزالة الهيميسليلوز واللجنين من عيناتنا.
في المرحلة الرابعة، ونحن تخضع لهحل حمض مع مساعدة من حمض الكبريتيك التي تنتج مونومرات الجلوكوز. وأخيرا، في المرحلة الخامسة، نستخدم المقايسة الخلع لتقدير محتوى السليلوز البلوري. جمع المواد النباتية من الدفيئة، وغسلها جيدا بالماء والهواء الجاف لمدة يومين، وفصل الأنسجة ونقل الأنسجة إلى حاويات وصفت بشكل فردي واحتضان في الحاضنة في 49 درجة مئوية لمدة 10 أيام.
ثم أخيرا، مقطعة إلى قطع باستخدام مقص أو شفرة. تجميد الأنسجة وتحميل في هاون والحشرات لطحن غرامة في مسحوق موحد أو بدلا من ذلك استخدام الفريزر / مطحنة. هنا، ونحن نثبت باستخدام الفريزر / مطحنة، لذلك نحن تحميل عينات الأنسجة لدينا في هذه القنينات طحن ووضعها في الفريزر / مطحنة وتشغيل سرعة 10 CP لمدة ثلاث دورات.
يتم جمع مسحوق الأنسجة في أنبوب فالكون كما هو موضح هنا. تزن 20 ملغ من مسحوق الأنسجة ونقلها إلى أنبوب ما قبل وزنها مل اثنين. إضافة مل واحد من البروتين solubilization العازلة لإزالة البروتينات. دوار.
جهاز طرد مركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. تجاهل الناتنات الفائق. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
إضافة مل واحد من الماء العقيم إلى بيليه الاحتفاظ بها. دوار. جهاز طرد مركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
إضافة مل واحد من 70٪ الإيثانول إلى بيليه الاحتفاظ بها. دوار. نقل إلى كتلة مئوية مسخن 70 درجة مع اهتزاز في وقت واحد لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة حضانة، جهاز الطرد المركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.
كرر هذه الخطوة مرة أخرى. إلى بيليه المحفوظة، إضافة مل واحد من الميثيلون 100٪. دوار. جهاز طرد مركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.
إضافة مل واحد من الميثانول الكلوروفورم. دوار. جهاز طرد مركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإضافة مل واحد من الأسيتون. دوار.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. جهاز طرد مركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. إعادة تجاهل supernatant والهواء الجاف لهم في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو الاستمرار عن طريق التجفيف فراغ.
تحميل العينات الخاصة بك في مجفف فراغ والهواء الجاف لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات أو حتى بيليه جافة تماما. وزن خمسة ملغ من استخراج جدار الخلية التي تم الحصول عليها من الخطوة السابقة. نقل إلى أنبوب غطاء المسمار مل اثنين.
وتشمل أيضا السيطرة الإيجابية في هذه المرحلة. استخدام اثنين ملغ من ورق تصفية Whatman لهذا الغرض. نقل إلى أنبوب غطاء المسمار مل اثنين.
إضافة 1.5 مل من كاشف Updegraff إلى كل استخراج جدار الخلية وزنها. دوامة واحتضان في 100 درجة مئوية في كتلة مسخن لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة حضانة، ونقل إلى رف.
السماح لها لتبرد على مقاعد البدلاء لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 15,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه.
أضف مل واحد من الماء العقيم. دوار. جهاز طرد مركزي عند 15,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تجاهل 500 ميكرولتر من الناتنات.
إضافة مل واحد من الأسيتون. دوار. جهاز طرد مركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. تجاهل مل واحد من العملاق.
إضافة مل واحد من الأسيتون. دوار. جهاز طرد مركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. تجاهل العملاق تماما.
إضافة مل واحد من الأسيتون. دوار. جهاز طرد مركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. تجاهل الناتنات الفائق.
جاف عند درجة مئوية 37 بين عشية وضحاها. بعد حضانة ليلة واحدة، نقل إلى رف. أضف مل واحد من حمض الكبريتيك بنسبة 67٪. دوار.
احتضان في 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز في وقت واحد. بعد ساعة واحدة حضانة، تأكد من بيليه يذوب تماما. نقل إلى رف.
هذه هي الخطوة الأخيرة لاستخراج السليلوز. الآن العينات جاهزة لتخفيف العينة. لعينة التخفيف، استخدم 10 ميكرولتر من كل عينة من الخطوة السابقة وإضافة 490 ميكرولتر من الماء العقيم.
كرر هذا لجميع العينات التجريبية. لإعداد منحنى معيار الجلوكوز، وإعداد مخزون جديد من واحد ملغ لكل مل الجلوكوز وإعداد صفر ميكروغرام إلى تركيزات 200 ميكروغرام بإضافة ملغ واحد لكل مل الجلوكوز في 20 زيادات ميكرولتر، وتصنع الحجم النهائي إلى مل واحد مع الماء العقيم. خذ 500 ميكرولتر من كل معيار معد في أنبوب غطاء المسمار وإضافة واحد مل 0.2٪ أرثرون.
والآن العينات جاهزة للسداد إضافة مل واحد من anthrone أعدت حديثا. تخلط على الفور عن طريق الدوامة ونقلها إلى الجليد.
كرر لجميع المعايير والعينات بنفس الطريقة. ثم نقل إلى كتلة درجة مئوية مسخن 100 لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق حضانة، ونقل إلى الجليد واحتضان لمدة خمس دقائق على الجليد.
بعد الحضانة، خذ 200 ميكرولتر من كل عينة في ثلاث نسخ متماثلة. كرر لكل من المعايير والعينات بنفس الطريقة. وتم تحميل لوحة محملة 96 بئرا في كاشف Multimode.
باستخدام برنامج Smart Max Pro، قمنا بتعيين إعداد الفلتر إلى 620 نانومتر. نوع لوحة إلى نوع 96 جيدا. حدد كل منطقة القراءة.
انقر فوق موافق. قرأ. قراءة لوحة. يمكنك الحصول على قراءات امتصاص كل من المعايير والعينات، والتي سيتم جمعها في ورقة إكسيل لمزيد من التحليل وتقدير محتوى السليلوز.
يتم إعداد منحنى الجلوكوز القياسي باستخدام تركيزات الجلوكوز في ميكروغرام لكل مل على المحور x وقيم الامتصاص الطبيعية للتركيز المعني عند 620 نانومتر على المحور ص. نحصل على خط الانحدار مع قيم m و c في الرسم البياني المبعثر المرسوم الذي نستخدمه لتقدير محتوى السليلوز البلوري العينة. في الخطوة الأولى، بلغ متوسط قيم OD 620 نانومتر.
ثم قمنا بتطبيع البيانات عن طريق طرح القيمة الفارغة. نحن نحسب تركيز الجلوكوز باستخدام الصيغة x يساوي OD ناقص c/m حيث نقوم بتوصيل قيم c و m من الخطوة السابقة لخط الانحدار في المنحنى القياسي. بما أن الحجم الإجمالي الذي تم استخدامه لإجراء الفحص للسحل هو 500 ميكرولتر، فإننا نقسمه على عامل التخفيف الثاني.
وبما أن حجم العينة الذي تم استخدامه كان 10 ميكرولتر فقط، فسوف نقسم أكثر على 10 للحصول على ميكروجرام لكل تركيز ميكروليتر من الجلوكوز وهو ما يعادل ملغ لكل ميل مكعب من التركيز. ثم استخدمنا عامل الرطوبة 1.11 وهو كسب الرطوبة في هذه العملية. وأخيرا، نقوم بحساب النسبة المئوية لمحتوى السليلوز البلوري بقسمته على وزن جدار الخلية، الذي يقترب من خمسة ملغ، ونضربه ب 100 للحصول على النسبة المئوية.
ثم قمنا بمتوسط محتوى السليلوز البلوري لثلاث نسخ بيولوجية للحصول على قيمة العينات الفردية ، والتي سيتم مقارنتها بمتوسط خط تجريبي آخر من ثلاث نسخ بيولوجية. ويمكن استخدام t-test لاختبار مستوى أهميتها. هنا في الجدول A، نعرض قيم الجدول للتركيز وOD المعنية في 620 نانومتر، والتي استخدمت كذلك لرسم رسم بياني مبعثر وخط انحدار مع قيم m و c التي استخدمت في C للحصول على اختلافات محتوى السليلوز بين الخطين التجريبيين.
في الختام، تظهر كلتا العينتين اختلافات السليلوز. شكرا للمشاهدة.
