Гипоксия является ключевым фактором развития рака, который вызывает геномную нестабильность и опухолевый генез. Мы демонстрируем метод генерации центральной гипоксии при солидном раке in vitro на основе технологии 3D-биопечати. Используя этот метод, радио гипоксический градиент может быть воспроизведен с использованием простой стратегии, которая сочетает в себе 3D-печатный газопроницаемый барьер и стеклянную крышку.
Эта технология гипоксического рака на чипе может быть использована для прогнозирования эффективности лекарств для облегчения назначения пациентом специфических противоопухолевых препаратов. И ожидается, что это также позволит быстро диагностировать агрессивный рак. Чтобы помочь в приготовлении трехмиллилитрового нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля, нарежьте 30 миллиграммовых коллагеновых губок на квадратные кусочки пять на пять миллиметров.
Поместите кусочки в стерильный стеклянный флакон размером 10 миллилитров и добавьте 2,4 миллилитра 0,2 микрона шприцевого фильтра 0,1 обычной соляной кислоты во флакон для трехдневной инкубации при четырех градусах Цельсия и 15 оборотах в минуту. После пищеварения процедите любые непереваренные частицы коллагена через 40-микронный клеточный ситечко и храните раствор кислого коллагена при четырех градусах Цельсия в течение семи дней. Чтобы отрегулировать рН 1% нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля, добавьте 30 микролитров раствора фенол-красного до конечной концентрации 1% и 300 микролитров 10X PBS до конечной концентрации 10% После смешивания и центрифугирования используйте один нормальный гидроксид натрия для нейтрализации рН до семи, проверяя изменение цвета и добавляя дистиллированную воду для получения общего объема трех миллилитров.
Затем храните скорректированный pH 1% нейтрализованный раствор коллагена предварительного геля при четырех градусах Цельсия для использования в течение трех дней. Чтобы предварительно проверить гелеобразование нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля, используйте пипетку с положительным смещением, чтобы добавить 50 микролитров капель коллагена в небольшую посуду и высиживают капли в инкубаторе с 37 градусами Цельсия в течение одного часа. В конце инкубации проверьте, изменился ли коллаген с прозрачного цвета на непрозрачный белый.
Наклоните контейнер, чтобы убедиться, что коллаген прилип к дну контейнера. И вылейте PBS на каплю, чтобы подтвердить, что конструкция коллагена не ломается в растворе. Для 3D-печати жертвенной формы PEVA щелкните Файл и сохраните тип файла как STL, чтобы преобразовать файл 3D CAD в файл STL, и нажмите Опция и выведите форму как ASCII для генерации G-кода.
Чтобы импортировать созданный STL-файл, щелкните Файл, откройте STL-файл и выберите сохраненный STL-файл. Для автоматической генерации G-кода жертвенной формы PEVA выберите срезовую модель обменника STL-CAD. Затем, чтобы сгенерировать пути печати для изготовления чипа, используйте сопло точности 50 калибра при пневматическом давлении 500 килопаскалей при 110 градусах Цельсия, чтобы напечатать жертвенную форму PEVA на стерильном клейком гидрофильном гистологическом слайде.
Чтобы отлить барьер PDMS, смешайте шесть миллилитров базового эластомера PDMS и 600 микролитров отверждающего агента в течение пяти минут в пластиковом резервуаре и загрузите однородно смешанный раствор в одноразовый шприц объемом 10 миллилитров. Шприц оснащен пластиковым коническим дозизатором 20 калибра и наполните жертвенную форму PEVA смешанным раствором PDMS. Смешанный PDMS наполнит эту жертвенную форму PEVA выпуклой поверхностью, и барьер будет выше, чем у формы.
После отверждения барьера PDMS в печи с температурой 40 градусов Цельсия в течение более 36 часов, чтобы избежать плавления PEVA, используйте пару прецизионных пинцетов для отсоединения жертвенной формы PEVA и стерилизуйте газопроницаемый барьер при 120 градусах Цельсия в автоклаве. Чтобы смешать раствор с раковыми клетками, повторно суспендируют каждый тип собранной клеточной гранулы в 20 микролитрах питательной среды и добавляют один миллилитр 1% нейтрализованного раствора коллагена предварительного геля в каждую из повторно суспендированных клеточных суспензий на влажном льду с мягким перемешиванием. Используйте пипетку с положительным смещением, чтобы смешать каждую клеточную суспензию.
При получении однородных растворов используйте положительную одноразовую пипетку для переноса инкапсулированных коллагеновых биочернил ячеек в отдельные одноразовые шприцы с тремя миллилитрами и храните шприцы при четырех градусах Цельсия до 3D-печати клеток. Для 3D-печати концентрических колец рак-строма преобразуйте соответствующий файл 3D CAD в формат файла STL и используйте обменник STL-CAD для генерации G-кода концентрических колец рака-стромы. Загрузите ячейку инкапсулированных коллагеновых биолитков в головку 3D-принтера и установите температуру головки и пластины на 15 градусов Цельсия.
Загрузите сгенерированный путь печати на управляющая программу 3D-принтера и нажмите кнопку Пуск, чтобы напечатать коллагеновые биочернила на газопроницаемом барьере в соответствии с загруженным G-кодом с пластиковой иглой 18 калибра при пневматическом давлении около 20 килопаскалей при 15 градусах Цельсия. В конце каждой операции печати вручную поместите стерилизованную стеклянную крышку 22 на 50 миллиметров поверх газопроницаемого барьера для создания гипоксического градиента. После генерации трех гипоксических раковых опухолей на чипах перенесите чипы в инкубатор с 37 градусами Цельсия в течение одного часа, чтобы сшить коллагеновые биочернила.
Когда все гипоксические раковые чипы будут напечатаны, аккуратно потрите крышку стекла поверх газопроницаемых барьеров с помощью скребка для плотного склеивания. Чтобы освежить среду культивирования клеток до чипов без отсоединения раковой конструкции, наклоните чипы и используйте пипетку, чтобы ввести 1,5 миллилитра среды роста эндотелиальных клеток в сторону каждого чипа. Гипоксический рак на чипе был разработан в виде концентрических колец, чтобы имитировать радиальную диффузию кислорода и истощение, наблюдаемые в раковых тканях.
После определения контрольного объема пространства, в котором кислород рассеивается и потребляется клетками, соответствующая клеточная плотность для генерации центральной гипоксии может быть определена с помощью вычислительного анализа конечных элементов. При 3D-печати клеток может быть создана разделенная концентрическая кольцевая структура рака-стромы для воспроизведения анатомических особенностей твердого рака. Количественно жизнеспособность клеток после печати обычно превышает 96%, подтверждая, что производственные условия подходят для раковых и стромальных клеток.
В этом репрезентативном анализе две группы сравнивали в соответствии с наличием и отсутствием градиента кислорода, чтобы проверить влияние гипоксического градиента на прогрессирование рака. В обоих условиях зрелые CD31 положительные эндотелиальные клетки присутствовали в периферических областях, что указывает на то, что пространственно узорчатые живые конструкции были получены с использованием технологии 3D-биопечати. По сравнению с отрицательным состоянием градиента кислорода градиентное положительное состояние продемонстрировало гипоксический градиент, указывающий на постепенную экспрессию HIF1 альфа.
Также наблюдались SHMT2-положительные псевдопализованные клетки и SOX2-положительные плюрипотентные клетки, свидетельствующие о наличии агрессивных патофизиологических особенностей солидного рака. Гипоксический рак на чипе является полезным инструментом для исследования патофизиологических характеристик солидных раковых заболеваний и динамических перекрестных помех между раковыми клетками и опухолевым генезом, способствующим микроокружению. Поскольку методология может быть адаптирована для разработки лекарственного средства для конкретного пациента в разумные сроки, ожидается, что этот подход преодолеет разрыв между моделями рака in vivo и in vitro.
