Изучение различных областей мозга является ступенькой к пониманию молекулярной и структурной сложности мозга. Этот протокол описывает систематическое рассечение мозга мыши для выделения отдельных областей мозга. С точки зрения анатомии мозга, это нисходящий подход, который можно легко воспроизвести.
Преимущества этого протокола двоякие. Во-первых, такой подход дает возможность понять молекулярные основы небольших, но критических областей мозга. Во-вторых, весь этот процесс рассечения достаточно короткий, чтобы обеспечить сохранение молекулярной целостности, что является критической предпосылкой обратного и молекулярного анализа.
Эта процедура включает в себя практику и деликатное обращение. Время здесь очень важно для поддержания структурных ориентиров и может быть достигнуто при надлежащем обучении и практике. Продемонстрировать процедуру удаления мозга мыши будет Сейд Мухи, химик-исследователь и биоинформатик из нашей лаборатории.
Дальнейшую демонстрацию процедуры рассечения мозга мыши будет Джеймс Мейерхофф, нейробиолог из нашей лаборатории. Для начала очистите и удалите кожу для хорошего захвата. Зажмите верхнюю челюсть обезглавленной головы гемостатом и используйте марлю, чтобы отразить кожу головы рострально.
Вставьте тонкие изогнутые ножницы в отверстие magnum, чтобы отделить прилипшие мозговые оболочки. Затем вставьте ножницы в отверстие основания черепа, где проходит спинной мозг с лезвием, направленным вертикально, но параллельным и прижимающимся к внутренней поверхности базальной пластинчатой кости, вращая лезвие на 45 градусов в левую сторону, а затем в правую сторону. Удалите затылочную кость во внутритеменной кости, чтобы обнажить мозжечок.
Выдвинуть ножницы рострально вдоль среднего сагиттального шва до брегмы и разрезать его, подняв вверх, чтобы избежать разрыва коры головного мозга. По мере того, как теменные кости поднимаются, определите и отрежьте оставшиеся менингеальные прикрепления. Сделайте два параллельных разреза в сагиттальной плоскости и удалите фрагменты лобной кости, избегая разрыва мозговой поверхности.
Разрезая менингеальные прикрепления и черепные нервы, переверните череп, чтобы гравитация помогла в удалении мозга в небольшую чашку, предварительно заполненную солевым раствором. Держите слуховую буллу нетронутой, чтобы анатомия гипофиза была идентифицируемой. Сделайте крайне маленький парасаггитальный разрез с обеих сторон в гребне мембранной палатки, удерживающей гипофиз на своем месте, и поднимите заднюю долю гипофиза ультратонкими щипцами.
Делают сагиттальный разрез между боковыми краями передней доли гипофиза в ближайшем тройничном нерве, затем вынимают переднюю долю гипофиза. Направьте источник белого света на ткань. Поместите мозг на предварительно охлажденный блок из нержавеющей стали и держите блок холодным, окружив его льдом в ледяном солевом растворе.
Периодически увлажняйте ткани ледяным солевым раствором для сохранения структур. Расположите мозг так, чтобы кора головного мозга была обращена вверх. Используя небольшие изогнутые щипцы, удалите мозжечок.
Используя дорсальный подход, сдвиньте закрытые лопасти небольших изогнутых щипцов под мозолистым телом и осторожно распределите его, чтобы втянуть неокортекс двусторонне, чтобы сохранить критически заметные ориентиры средней линии. Конечная сторона вверх, такие структуры, как оптический хиазм, гипоталамус, обонятельные луковицы, продолговатый мозг, гипофиз и мост понтина будут видны. Попробуйте разделить полушария.
Переверните вентральный участок мозга вверх и сделайте средний сагиттальный разрез, начиная с дорсума между обонятельными луковицами в полушариях головного мозга. Удалите продолговатый мозг, а затем аккуратно разделите два полушария. Затем сделайте корональный разрез на внутренней окраине пруда, чтобы получить задний мозг и отделить продолговатый мозг на заднем краю прудов.
Переверните ткани мозга для тщательного разделения двух полушарий головного мозга. Удалите обонятельную луковицу на этом этапе. Делают корональный разрез на один миллиметр впереди гену мозолистого тела и удаляют вспомогательные обонятельные луковицы с последующим разделением медиальной и латеральной префронтальной коры.
Частично разрезать горизонтально или коронально через поперечную часть передней комиссуры от средней линии под передним рогом бокового желудочка, чтобы освободить септальное ядро дорсально и вентральное полосатое вентральное. Удалите небольшое количество коры с боковой поверхности, чтобы удалить ядро и обонятельный бугорок. Отделите ростральную часть полосатого тела от вышележащей коры с помощью изогнутого скальпеля, разрезанного сразу за внешней капсулой.
Определите ядра перегородки или перегородки и выделите их из этого отдела. Сделайте изогнутый разрез, чтобы отделить гипоталамус на этом этапе. Это будет сделано с использованием частичного коронального разреза сзади к маммиллярным телам, простирающегося только так далеко, как гипоталамическая борозда.
Затем освободите поперечное сечение гипоталамуса с парасагиттальным срезом по длине гипоталамической борозды. Выявить боковые желудочки для выявления дополнительных внутрилимбических связей в остальных компонентах лимбической системы. На внутренней части внутренней коры наблюдается веерообразная структура после вскрытия желудочка.
Используйте веерообразную структуру в энторинальной коре, чтобы определить края с целью рассечения, а затем идентифицировать и удалить миндалину, энторинальную кору, заднюю поясную кору и гиппокамп. Подтвердить идентификацию таламуса можно визуализацией stria medullaris на его дорсальной поверхности, простирающейся в средней линии ростральной кортикальной плоскости. Отделите таламус полностью от среднего мозга корональным разрезом.
Этот протокол может быть использован для немедленного удаления мозга из черепа с последующим рассечением. Рассеченные ткани могут быть сохранены и обработаны позже в зависимости от требований исследования. Извлеченная РНК из нескольких рассеченных тканей может быть проанализирована на экспрессию генов.
Репрезентативные результаты были получены с использованием собранного мозга, который хранился при минус 80 градусах Цельсия в течение нескольких месяцев до извлечения РНК. Различные области мозга вместе с данными о весе были собраны в рамках модели ПТСР, подвергшейся воздействию социального стресса агрессора. Здесь показаны концентрации РНК и спектрофотометрические показания.
Следуя этому протоколу, убедитесь, что ткани постоянно охлаждаются, удерживая мозг на ледяной стальной блоке и периодически обливая ткань ледяным физиологическим раствором. Как только ткани собраны и немедленно заморожены, их можно использовать для анализов, таких как транскриптомика, метаболомика и протеомика в более позднее время.
