Этот протокол может обеспечить вариативную методологическую ссылку для понимания сложной нейрососудистой структуры мозговой оболочки черепа на физиологическом или патологическом состоянии. Используя преимущества прозрачной цельной твердой мозговой оболочки, пространственная корреляция дуральных иммунореактивных нервных волокон CGRP и кровеносных сосудов может быть продемонстрирована в 3D-виде. После эвтаназии крысы транскардиально перфузировали ее 100 миллилитрами 0,9% нормального физиологического раствора, а затем от 250 до 300 миллилитров 4% параформальдегида в 0,1 молярном фосфатном буфере.
Когда закончите, удалите кожу головы и откройте череп, чтобы обнажить дурную мозговую оболочку и дорсальную сторону мозга. Рассекте черепную мозговую мозговую оболочку вдоль ствола мозга до обонятельной луковицы целым рисунком крепления. Промыть черепную дурную мозговой оболочке в 0,1 молярном фосфатном буфере примерно на одну минуту и инкубировать ее в блокирующем растворе.
Переведите твердое мозговое тело в антитело против CGRP мыши на ночь. На следующий день промыть твердое мозговое поверье три раза в 0,1 молярного фосфатного буфера. Инкубируют дурную оболочку матки в смешанном растворе ослиного антимышечного вторичного антитела Alexa Fluor 488 и фаллоидина 568 в 0,1.
Молярный фосфатный буфер, содержащий 1%нормальной ослиной сыворотки и 0,5%тритона Х-100 в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Затем трижды промыть твердые оболочки в 0,1-го молярного фосфатного буфера, обрезать края и установить его на слайды микроскопа. Перед наблюдением надеваем на крышку слипы с 50% глицерином.
С помощью флуоресцентного микроскопа визуализируйте всю мочную мозговую оболочку, а затем сделайте снимки иммунореактивных нервных волокон CGRP и меченых фаллоидином кровеносных сосудов в твердой мозговой оболочке с помощью конфокального микроскопа. Побрить голову крысы электрической бритвой, затем приставить крысе тупые ушные перекладиски и поместить ее на стереотаксическое устройство. Расположите держатель рта и нанесите офтальмологическую мазь на глаза.
Очистите хирургическую сторону кожи головы, используя 75% этанол и сделайте разрез вдоль средней линии кожи головы. Тупо удалите проницательную часть и мышечные ткани от черепа с помощью стерильных аппликаторов с ватными наконечниками. Просверлите небольшое отверстие с помощью сверла с круглым наконечником на левой теменной и височной костях над средней менингеальной артерией.
Постройте банк вокруг отверстия с зубным силикатным цементом и добавьте два микролитра фторгольда в отверстие вокруг средней менингеальной артерии с помощью микроприца 10 микролитров. Закройте отверстие небольшим кусочком гемостатической губки. Налейте на отверстие кусочек парафиновой пленки и запечатайте края костным воском.
За швы на швах раны стерильной нитью. Держите крыс в теплом месте до тех пор, пока они полностью не выздоровеют. Затем верните крыс обратно в свои клетки.
Через семь дней выживания перфузируют этих крыс 0,9% нормального физиологического раствора, а затем 4% параформальдегида в 0,1-м молярном фосфатном буфере. Рассеките ТГ и шейку матки от одного до четырех ДРГ, затем вырежьте их толщиной 30 микрометров на криостатной микротомовой системе в сагиттальном направлении. И смонтировать секции на стеклянных слайдах с силановым покрытием.
Обведите участки гистохимической ручкой и высиживая их в течение 30 минут в блокирующем растворе. Переложите образцы в раствор антифторгольда кролика и анти-CGRP антитела мыши и инкубировать при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день промыть участки трижды в 0,1 молярном фосфатном буфере.
Инкубируют вымытые участки в смешанном растворе ослиного анти-кролика Alexa Fluor 594 и ослиного антимышеского Alexa Fluor 488 вторичного антитела. Затем трижды промыть их в 0,1-ти молярный фосфатный буфер и нанести на крышки с 50% глицерином для наблюдения. Сделайте снимки флюорогольдных меченых нейронов в ТГ и ДРГ при ультрафиолетовом освещении с помощью флуоресцентного микроскопа.
Затем захватите изображения фторгольдовых и CGRP-меченых нейронов в TG и DRG. После иммунофлуоресцентного и флуоресцентного гистохимического окрашивания CGRP и фаллоидином, иммунореактивные нервные волокна CGRP и фаллоидин, меченые дуральными артериолами и соединительными тканями, были четко визуализированы по всей твердой мозговой оболочке горы в 3D-паттерне. Как толстые, так и тонкие иммунореактивные нервные волокна CGRP проходят параллельно дуральным артериям вокруг сосудистой стенки или между кровеносными сосудами.
Через семь дней после применения фторгольда на области средней менингеальной артерии и мозговой мозговой оболочки черепа крысы фторгольдные меченые нейроны были обнаружены в ТГ и цервикальных ДРГ на ипсилатеральной стороне применения индикатора, что непосредственно наблюдалось под ультрафиолетовым освещением флуоресцентной микроскопии. Флюорогольдовые меченые нейроны были обнаружены во всех трех ветвях ТГ, с более высокими концентрациями на офтальмологическом и верхнечелюстном отделах и с более низкими концентрациями на нижнечелюстном отделе. Некоторые из фторгольдовых меченых нейронов также наблюдались в шейных двух-трех DRG.
Эти двойные иммунофлуоресцентные репрезентативные фотографии показывают сенсорные нейроны в ТГ и ДРГ. Меченые нейроны с FG, CGRP, а также FG и CGRP были визуализированы с помощью двойной иммунофлуоресценции. При попытке этого протокола не забудьте полностью рассекать черепную дурную оболочку и наклеить ее на слайд в виде целого шаблона крепления.
