可视化与钙西通宁基因相关的肽免疫活性内活性与免疫发光和神经追踪

该协议可能为理解颅骨母体在生理或病理状况上的复杂神经血管结构提供可变的方法参考。利用透明的全坐骑杜拉母体，在3D视野中可以证明杜拉尔CGRP免疫活性神经纤维和血管的痉挛相关性。对大鼠实施安乐死后，用100毫升的0.9%正常盐水进行心肌增补，然后在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中注入250至300毫升4%的副甲醛。

完成后，取出头部皮肤并打开头骨，露出大脑的杜拉母体和后侧。沿着脑系统解剖颅骨，以整个安装模式将颅骨灯泡分解到嗅球上。在 0.1 摩尔磷酸盐缓冲区中冲洗颅骨杜拉母体约一分钟，并在阻塞溶液中孵育。

将杜拉母体在一夜之间转移到鼠标抗CGRP抗体中。第二天，用0.1摩尔磷酸盐缓冲器洗三次杜拉母校。在驴抗鼠标 Alexa Fluor 488 二次抗体和 0.1 中的 568 的混合溶液中孵育杜拉母体。

在室温下含有1%普通驴血清和0.5%Triton X-100的磷酸盐缓冲器，在室温下1.5小时。然后，在 0.1 摩尔磷酸盐缓冲器中洗三次杜拉母校，修剪边缘，并将其安装在显微镜滑梯上。在观察前用50%甘油盖上盖片。

用荧光显微镜拍摄整个杜拉母校，然后使用共聚焦显微镜拍摄杜拉母校中 CGRP 免疫活性神经纤维和巴洛丁标记血管的图像。用电动剃须刀剃掉老鼠的头，然后把钝耳棒放在老鼠身上，放在立体声装置上。将口腔支架放置，并在眼睛上涂抹眼药膏。

使用 75% 乙醇清洁头部皮肤的手术侧，并在头皮中线进行切口。使用无菌棉尖贴施用器从头骨上模糊地去除围产层和肌肉组织。使用毛刺钻孔钻一个小孔，在中间脑膜动脉上方的左侧切口和时间骨骼上使用圆尖位。

用牙科硅酸盐水泥在孔周围建造一个银行，用10微升微注射器将两微升氟金加入中间脑膜动脉周围的孔中。用一小块止血海绵盖住洞。在孔上放一块石蜡膜，用骨蜡封住边缘。

用无菌螺纹缝合伤口。将老鼠关在温暖的区域，直到它们完全康复。然后把老鼠送回笼子里。

存活7天后，用0.9%的正常盐水灌注这些大鼠，然后在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中注入4%的副甲醛。解剖出TG和颈椎一到四个DPG，然后在下垂方向的低温微原子系统上以30微米的厚度切割它们。并将部分安装在硅烷涂层玻璃滑梯上。

用组织化学笔将各部分圈起来，并在阻塞溶液中孵育30分钟。将样品转移到兔子抗氟金和小鼠抗CGRP抗体的溶液中，并在四摄氏度的夜间孵化。第二天，用0.1摩尔磷酸盐缓冲器清洗三次。

将洗涤部分孵化在驴防兔亚历克萨氟 594 和驴反鼠标 Alexa Fluor 488 次要抗体的混合溶液中。然后在 0.1 摩尔磷酸盐缓冲区清洗三次，并涂抹盖片，用 50% 甘油进行观察。使用荧光显微镜拍摄 TG 和 UV 照明下 DRG 中标有荧光的神经元图像。

然后，捕获 TG 和 DRG 中标记的氟金和 CGRP 标记神经元的图像。免疫荧光和荧光组织染色与CGRP和phalloidin后，CGRP免疫活性神经纤维和标有杜拉尔动脉和结缔组织的phalloidin在整个坐骑颅骨母体中以3D模式清晰可视化。厚和薄的CGRP免疫性神经纤维与血管壁周围的神经动脉或血管之间平行运行。

在中脑膜动脉和大鼠颅状杜拉母体区域应用氟金应用7天后，在示踪剂应用的ipsilathal侧的TG和颈椎DPG中检测到荧光标记神经元，在荧光显微镜的紫外线照射下直接观察到。在TG的所有三个分支中都发现了氟罗戈尔德标记神经元，眼科和最大细分部的浓度较高，在支气管分裂上的浓度较低。在宫颈两到三个DPG中也观察到了一些标有氟金标签的神经元。

这些双免疫荧光代表照片显示TG和DMG中的感官神经元。带有FG、CGRP以及FG和CGRP的标记神经元通过双免疫荧光可视化。在尝试此协议时，请记住完全解剖颅面 dura 母校，并将其粘贴在整个安装模式的幻灯片上。