Этот метод может ответить на ключевые вопросы о фосфорилации пяти-премьер конце ДНК или РНК молекулы специального класса ферментов, известных как полинуклеотид киназы. Основным преимуществом этого метода является его разрешение для обнаружения очень небольших изменений в ДНК и РНК-субстратах. Начните с подготовки реакций фермента РНК киназы.
Для каждой реакции объедините один микролитер из 500 наномолярных РНК-субстратов. 8.3 микролитров 130 наномолярных последних, GRC 3 и 0,2 микролитров пяти миллимолярной EDTA. Установите тепловой блок до 37 градусов по Цельсию.
Затем смешайте 0,5 микролитров суб-запаса АТФ из серии концентраций с одной смесью фермента РНК и поместите реакцию на тепловой блок. Продолжайте смешивать реакции и помещайте их на тепловой блок с интервалом в десять секунд. После 60-минутной инкубации на тепловом блоке, утолить каждую реакцию, пики его с 10 микролитров мочевины загрузки красителя.
Немедленно выполняте вниз по течению анализ или храните реакции на отрицательных 20 градусах Celsius, чтобы быть проанализированы на более поздний срок. Чтобы подготовить 15%denaturing акриламид гель раствор, объединить 22,5 миллилитров предварительно смешанных 40%29 к одному акриламида / бис акриламида раствора. Шесть миллилитров по десять х TBE.
28,8 г мочевины. И RNase бесплатная вода в общей сложности 59 миллилитров. Затем аккуратно перемешать раствор.
Нагрейте раствор в микроволновой печи в течение 20 секунд. Перемешать и немедленно вернуть его в микроволновую печь еще на 20 секунд. Аккуратно перемешайте раствор до полного растворения мочевины.
Поместите стеклянный стакан в ванну на мелководье, содержащую холодную воду в течение пяти минут, убедившись, что уровень холодной воды, окружающей стеклянный стакан выше уровня раствора внутри стакана. Когда раствор остынет, процепив и от газе его с 0,2 два микрометра одноразовый блок фильтрации для удаления твердых частиц и микроскопических пузырьков воздуха. Вымойте короткую и длинную стеклянную тарелку с мылом и водой, затем распылите каждую тарелку 95%этанолом и протрите стекло, чтобы удалить влагу.
Поднимите длинную пластину со скамейки сверху, поместив его на верхней части коробки. Затем распорежьте 0,4-миллиметровые проемы по длинным краям пластины. Положите короткую пластину поверх длинной пластины, убедившись, что края короткой пластины, длинной пластины и спейсеры выровнены.
Затем зажим каждой стороны с тремя равномерно разметь металлические зажимы. Добавьте 24 микролитров TEMED в раствор акриламида и смешайте его. Затем добавьте 600 микролитров 10%APS и сразу же залейте раствор между стеклянными пластинами.
Заливка акриламид решение между стеклянной пластины бутерброд может быть очень сложной задачей. Чтобы избежать пузырьков воздуха, нажмите сэндвич стеклянной пластины, пока вы заливки вашего решения. Аккуратно добавьте чистый гребень 32-хорошо в верхней части стеклянной пластины бутерброд.
И дайте акриламиду полимеризуться в течение 30 минут. Чтобы запустить гель, установите тепловой блок до 75 градусов по Цельсию. Удалите металлические зажимы.
И тщательно вымыть и высушить стеклянную тарелку бутерброд. Позиция пластины бутерброд и гель аппарат с короткой пластиной лицом вперед и подготовить 0,5 X TBE работает буфер, объединив 100 миллилитров 10 X TBE с 1,9 литров RNase свободной воды. Добавьте 600 миллилитров бегущего буфера в верхнюю и нижнюю камеры аппарата.
Аккуратно снимите гребень с геля и тщательно промойте колодцы шприцем. Предварительно запустите гель при 50 Вт в течение 30 минут. Затем снова промыть колодцы.
Сообщение спина утолить реакции и инкубировать их при 75 градусов по Цельсию в течение трех минут. Повторите вращение импульса и немедленно загрузите 10 микролитров каждого образца на гель. Затем запустите гель в течение трех часов при 50 Вт.
Когда пробег закончится, выключите электроснабжение и слейте верхнюю камеру аппарата. Вымойте и высушите внешнюю сторону сэндвича стеклянной пластины. Затем накройте фольгой и перенесите на лазерный сканер для визуализации.
Намонтировать сэндвич со стеклянной пластиной на сцену лазерного сканера. Установите возбуждение и выброс длин волн для желаемого пола и изображение геля. Здесь показан репрезентативный успешный денатурированный гель титрования АТФ с фиксированным количеством последнего комплекса GRC 3.
Добавление фермента привело к последнему опосредованное расщепление РНК Saccharomyces cerevisiae ITS два РНК субстрата, что приводит к определенным фрагментом РНК. После добавления СПС фрагмент РНК С2 был фосфорилирован ГРК3 PNK. Для визуализации фосфорилирования фрагмента РНК С2 относительное количество нефосфорилированной и фосфорилированной РНК С2 было построено против концентрации АТФ.
Наш представитель неудачных денатурации гель показан здесь. 21 нуклеотидный субстрат РНК содержал продукты деградации, которые пересекались с фосфорилированным продуктом и не позволяют точно количественно оценить фосфорилирование. В отличие от этого, кратчайший продукт деградации РНК может быть успешно проанализирован, потому что эта область геля не содержит каких-либо дополнительных видов РНК, которые препятствуют точной количественной оценки его фосфорилированного аналога.
Самое главное помнить при попытке этого протокола, чтобы промыть колодцы геля, чтобы обеспечить даже загрузку вашего образца. После этой процедуры можно было бы провести эксперимент по обороту РНК. Для измерения темпов деградации РНК фосфорилирование часто сигнализирует о начале деградации РНК.
Этот метод прокладывает путь для ответа на подробные вопросы о деятельности специфики и кинетики полинуклеотидных киназ.
