Este método pode responder a perguntas-chave sobre a fosforilação da extremidade cinco-prime das moléculas de DNA ou RNA por uma classe especial de enzimas conhecidas como cinase de polinucleotídeos. A principal vantagem dessa técnica é que ela tem a resolução de detectar pequenas alterações no DNA e substratos de RNA. Comece preparando as reações de quinase da enzima RNA.
Para cada reação, combine um microliter de 500 substrato de RNA nanomolar. 8,3 microliters de 130 nanomolars últimos, 3 GRC e 0,2 microliters de cinco mililitros EDTA. Coloque o bloco de calor em 37 graus Celsius.
Em seguida, misture 0,5 microliters de um sub estoque ATP da série de concentração com uma mistura de enzima RNA e coloque a reação no bloco de calor. Continue misturando as reações e colocando-as no bloco de calor em intervalos de dez segundos. Após uma incubação de 60 minutos no bloco de calor, sacie cada reação, espiando-a com 10 microliters de corante de carregamento de ureia.
Realize imediatamente a análise a jusante ou armazene as reações a 20 graus Celsius negativos a serem analisadas posteriormente. Para preparar uma solução de gel de acrilamida de 15% de desnaturação, combine 22,5 mililitros de solução pré-misturada de 40%29 a uma solução de acrilamida/bis. Seis mililitros de dez x TBE.
28,8 gramas de ureia. E rnase água livre para um volume total de 59 mililitros. Em seguida, mexa suavemente a solução.
Aqueça a solução no micro-ondas por 20 segundos. Mexa-o e devolva-o imediatamente ao micro-ondas por mais 20 segundos. Mexa suavemente a solução até que a ureia esteja completamente dissolvida.
Coloque o béquer de vidro em um banho de água rasa, contendo água fria por cinco minutos, certificando-se de que o nível de água fria ao redor do copo de vidro esteja acima do nível de solução dentro do copo de vidro. Quando a solução estiver fria, filtre-a e desafocar com uma unidade de filtragem descartável de 0,2 micrômetro para remover partículas e bolhas de ar microscópicas. Lave uma placa de vidro curta e longa com água e sabão, depois pulverize cada prato com 95% de etanol e limpe o copo para remover qualquer umidade.
Eleve a placa longa do topo do banco colocando-a em cima de uma caixa. Em seguida, posicione espaçadores de 0,4 milímetros ao longo das bordas longas da placa. Coloque a placa curta em cima da placa longa, certificando-se de que as bordas da placa curta, placa longa e espaçadores estejam alinhados.
Em seguida, aperte cada lado com três grampos metálicos espaçados uniformemente. Adicione 24 microliters de TEMED à solução de acrilamida e misture-a. Em seguida, adicione 600 microliters de 10% APS e despeje imediatamente a solução entre as placas de vidro.
Derramar a solução de acrilamida entre o sanduíche de placa de vidro pode ser realmente desafiador. Para evitar bolhas de ar, toque no sanduíche de placa de vidro enquanto estiver servindo sua solução. Adicione cuidadosamente um pente limpo de 32 poços na parte superior do sanduíche de placa de vidro.
E deixe a acrilamida polimerizar por 30 minutos. Para executar o gel, coloque o bloco de calor em 75 graus Celsius. Remova os grampos metálicos.
E lave bem e seque o sanduíche de prato de vidro. Posicione o sanduíche de placa e o aparelho de gel com a placa curta voltada para a frente e prepare o tampão de corrida 0,5 X TBE combinando 100 mililitros de 10 X TBE com 1,9 litros de água livre RNase. Adicione 600 mililitros do buffer de execução às câmaras superior e inferior do aparelho.
Retire suavemente o pente do gel e enxágue bem os poços com uma seringa. Pré-execute o gel em 50 Watts por 30 minutos. Em seguida, enxágue os poços novamente.
Depois gire as reações de saciar e incuba-las a 75 graus Celsius por três minutos. Repita o giro de pulso e carregue imediatamente 10 microlitros de cada amostra no gel. Em seguida, executar o gel por três horas em 50 Watts.
Quando a corrida terminar, desligue a fonte de alimentação e drene a câmara superior do aparelho. Lave e seque o lado externo do sanduíche de placa de vidro. Em seguida, cubra-o com papel alumínio e transfira-o para um scanner a laser para imagens.
Coloque o sanduíche de placa de vidro no palco do scanner laser. Defina os comprimentos de onda de excitação e emissão para o piso desejado e imagem do gel. Mostrado aqui é um gel de desnaturamento bem-sucedido representativo de uma titulação de ATP com uma quantidade fixa de um último GRC três complexo.
A adição de enzima resultou no último decote de RNA mediado do Saccharomyces cerevisiae SEU substrato de RNA, levando a um fragmento de RNA definido. Após a adição de ATP, o fragmento de RNA C2 foi fosfoilado pela GrC3 PNK. Para visualizar a fosforilação do fragmento de RNA C2, a quantidade relativa de C2 RNA não fosforilado e fosforilado foi plotada contra a concentração atp.
Nosso representante de gel de desnaturing sem sucesso é mostrado aqui. O substrato rna nucleotídeo de 21 nucleotídeos continha produtos de degradação, que se sobrepunham ao produto fosforilado e impossibilitaram quantificar com precisão a fosforilação. Em contraste, o produto de degradação de RNA mais curto poderia ser analisado com sucesso porque esta área do gel não continha nenhuma espécie adicional de RNA que impedisse a quantificação precisa de sua contraparte fosfoilada.
O mais importante a ser lembrado ao tentar este protocolo é enxaguar os poços do gel para garantir o carregamento uniforme da sua amostra. Após este procedimento, um experimento de rotatividade de RNA poderia ser realizado. Para medir as taxas de degradação do RNA, a fosforilação muitas vezes sinaliza o início da degradação do RNA.
Esta técnica abre caminho para responder perguntas detalhadas sobre a especificidade das atividades e cinéticas das cinesases polinucleotídeos.
