Этот протокол позволяет быстро и легко обнаруживать первичные реснички в культурных клетках, в различных исследовательских начинаниях. Метод может быть использован в беспорядке, которые влияют на базальные тела первичных ресничок. Эта процедура также может быть применена для окрашивания первичных ресничок в парафин встроенной ткани или для других экспериментов, где флуоресценция необходима.
Начните с автоклавирования 22 на 22 миллиметра крышки скользит, и подготовка материалов для эксперимента. Оттепель FBS и пенициллин стрептомицин, и тепло культуры средней до комнатной температуры. Прохождение клеток с трипсином EDTA и PBS.
Приготовьте свежий 4%paraformaldehyde, культурную среду и 1%желатиновый раствор, в соответствии с рукописными указаниями. Затем очистите капот ламинарного потока с 70% этанола, и поместите все необходимые материалы внутри. Параформальдегид чрезвычайно опасен.
Правильный СИЗ должен носить во все времена, и он должен быть обработан только в химическом капюшоне. После выращивания нужных клеток до 70% слияния удалите их из инкубатора и поместите их в капот ламинарного потока. Удалить культуру среды и промыть клетки дважды с PBS.
Добавьте в культурную колбу около двух миллилитров 0,25%трипсина EDTA и инкубировать ее при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Периодически проверяйте клетки на перевернутом микроскопе для мониторинга отслоения. Когда клетки отделились мягко повторно их в 10 миллилитров культуры среды, трубопровод тщательно создать одну подвеску клетки.
Перенесите подвеску клетки на 50 миллилитровую коническую трубку и центрифуга в 200 раз G'в течение пяти минут. Декант супернатант затем добавить 10 миллилитров культуры среды, и осторожно повторно гранулы. Возьмите 20 микролитров клеточной подвески и смешайте его с трипан-синим при соотношении один к одному объему.
Затем подсчитайте клетки с помощью стандартной гемоцитометрии. Поместите крышку скольжения внутри каждого хорошо из шести пластины хорошо, и пальто крышка скольжения с двумя миллилитров желатина раствор, который поможет клетки, прикрепленные к крышке скольжения. Снимите желатин и дайте пластине высохнуть в течение нескольких минут.
Семя 100 000 фибробластов в каждый колодец и добавить два миллилитров культуры среды. Затем инкубировать клетки в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию, пять процентов углекислого газа, и 90%относительной влажности. После инкубации лечить клетки, чтобы вызвать цилиацию.
Разогреть 4%paraformaldehyde до комнатной температуры, и подготовить пастбища пипетки, ABS, контейнер для отходов, 15 миллилитров конических труб, микро пипетки, и советы. Возьмите клетки из инкубатора, и поместите их на скамейке лаборатории. Удалите мультимедиа из каждого хорошо, оставляя крышку скольжения.
Аккуратно мыть клетки три раза с двумя миллилитров PBS. Затем добавьте два миллилитров 4%PFA в каждый колодец, чтобы исправить клетки. Инкубировать пластину в течение 10 минут при комнатной температуре, затем удалить PFA, и повторить моет с PBS.
Добавьте два миллилитров по 0,5%Triton X-100 к каждому хорошо, и инкубировать пластину в течение 15 минут. Затем мыть колодцы четыре раза с PBS. Чтобы сделать блокирующий раствор, разморозить сыворотку козы в течение пяти минут, и разбавить его в PBS в соотношении от одного до 20.
Добавьте 150 микролитров этого раствора к каждой крышке скольжения, и инкубировать пластину в течение 20 минут. Оттепель основных антител в течение пяти минут, и разбавить их отдельно в PBS, как описано в тексте рукописи. Удалите блокирующий раствор из крышки скользит и добавить 150 микролитров обоих антител решений.
Затем инкубировать пластину в течение 60 минут при комнатной температуре. Удалить основные антитела и аккуратно мыть крышку скользит три раза с двумя миллилитров PBS. Разбавить Cy3 Овцы Anti-Mouse и Alexa fluor 488 Коза анти-Rabbit в PBS, на один к 300 отношение, и добавить 150 микролитров обоих вторичных антител решений для покрытия скольжения.
Подготовь рабочий раствор DAPI, разбавляя 10 микролитров запаса в 50 миллилитров PBS, и добавьте два миллилитров этого разбавления в крышку скользит. Инкубировать пластину в течение пяти минут в темноте, при комнатной температуре. Перед размещением крышки скользит на слайдах, подготовить две иглы, пинцет, и монтаж средств массовой информации, и этикетки все слайды.
Удалите раствор DAPI из колодцев, и мыть их три раза с PBS. Положите одну каплю монтажных средств массовой информации на каждом слайде. Используйте иглу, чтобы аккуратно поднять крышку скольжения от дна хорошо.
Затем переверните его и аккуратно поместите его над каплей монтажа средств массовой информации с помощью пинцета. Аккуратно удалите пузырьки. Защитите горки от света и храните их на ночь при четырех градусах цельсия.
На следующий день используйте флуоресцентный или конфокальный микроскоп с высоким увеличением, чтобы визуализировать первичные реснички. Этот протокол был использован для фиксации иммуносттеня, и изображение различных клеточных линий, выражаюющих первичные реснички. Когда мыши миобласты подвергались ионизирующему облучению в различных дозах, было установлено, что более высокие дозы вызывают появление нескольких первичных ресничок.
В то время как низкие дозы привели к появлению одиночных первичных ресничок. Аналогичным образом, когда фибробласты легких человека излучались в низкой дозе, одиночные первичные реснички были обнаружены иммунофлюоресценцией. Увеличение первичных ресничок наблюдалось у эмбриональных фибробластов мыши, которые голодали, демонстрируя, что метаболический стресс влияет на случаи первичных ресничок.
Когда фибробласты кожи были обработаны 120 наномолярный доксорубицин, они выразили один первичный цилий. Более высокие дозы вызывают появление нескольких первичных ресничок. Фибробласты, обработанные 1,25 наномолярного такстола, также выразили один первичный цилий.
Но несколько ресничок не были обнаружены после лечения с более высокими дозами. При открытии этого протокола убедитесь, что следовать всем правилам СИЗ. Имейте в виду культурные потребности вашей клеточной линии выбора и выбрали ваши антитела тщательно.
Эта процедура не может быть непосредственно следуют другие процедуры, так как клетки являются безвозвратными. Вместо этого следует запрограммировать параллельные эксперименты.
