Молекулярно-динамическое моделирование является вычислительной техникой, которая может быть использована для изучения молекулярных движений и может выявить конформациальные изменения, критически важные для понимания биохимической и клеточной функции. Прощупыв диапазон динамических движений, доступных для макромолекулы трудно. Использование результатов молекулярно-динамического моделирования в сочетании с экспериментальными данными позволяет оценить их функциональную значимость.
Мы продемонстрируем с помощью молекулярно-динамического моделирования, как мутации, наблюдаемые у онкологических больных, влияют на EGFR, нацеленные на подтверждения и связывание лигандов. Чтобы подготовить дикий тип апо активной структуры EGFR нашей киназы, откройте программу визуализации Kymera, и под меню файла, нажмите принести ID.Select базы данных белка банка данных и указать код банка данных белка 2GS2. Для создания недостающих структурных элементов 2GS2 приобретайте эти сегменты у других структур EGFR.
Чтобы построить пять остатков глутамата 746 аланина 750 ELREA удаления в EGFR, нажмите любимый, последовательность, и показать последовательность, чтобы открыть дикий тип 2GS2 последовательности. И в результате окна последовательности, нажмите редактировать и добавить последовательность, чтобы выбрать удаление мутанта FASTA формат последовательности. В окне выравнивания выберите структуру и модель или гомологию.
В всплывающем окне укажите композитную структуру 2GS2 в качестве шаблона и мутантную последовательность в качестве запроса, который будет смоделирован, а затем выберите модель мутанта из полученных моделей на основе оценки zDOPE и визуального осмотра. Чтобы подготовить неактивную структуру киназы EGFR дикого типа, откройте структуру Банка данных 2GS7 и добавьте недостающие сегменты из других структур EGFR, моделируя форму мутанта удаления, как это было продемонстрировано. Для подготовки активной структуры киназы КИНАзы с использованием киназы СПС, используя структуру банка данных 2ITX в качестве принципиальной структуры, строя недостающие сегменты с использованием других структур EGFR и моделируя форму мутанта удаления с помощью модельера, как это было продемонстрировано.
Чтобы построить асимметричную структуру димера дикого типа EGFR, откройте 2GS2 в Kymera и нажмите инструменты, более высокую структуру порядка и ячейку единицы для преобразования структуры в биологическую сборку, которая содержит активатор и приемник киназы в асимметричном расположении. Выберите структуру 2GS2 и введите копии, затем выберите и сохраните один асимметричный димер из нескольких копий димера в результате операций симметрии. Чтобы построить аланин 702 валин мутант, выберите инструменты, редактирование структуры, и ротамеры, чтобы заменить аланин 702 с валином.
Откройте структуры в Maestro и нажмите кнопку мастера приготовления белка, затем выберите добавить атомы водорода и заполнить недостающие атомы боковой цепи и нажмите предварительной обработки. Чтобы определить состояния протонации ионизируемых остатков при рН 7.0, нажмите уточнить и использовать PROPKA для оптимизации ориентации аспарагина, глутамина и гистамина остатков для водорода связи, а затем свести к минимуму структуру. Чтобы настроить систему моделирования, откройте программу LEAP и импортировать силовое поле Amber FF14SB и молекулы воды TIP3P.
Для систем, связанных с АТФ, параметры импорта АТФ и загрузка структуры. Solvate структуры в октагедральной коробке с явным TIP3P молекулы воды, которая простирается 10 ангстремов во всех направлениях от поверхности атомов белка. Проверьте систему ремня и добавьте необходимые ионы, чтобы нейтрализовать его.
Чтобы достаточно моделировать биомолекулярные системы, добавьте дополнительные атомы натрия и хлорида в коробку моделирования, чтобы довести концентрацию соли в системе до 0,15 молара, затем создать и сохранить топологию и координировать файлы системы, чтобы служить в качестве входных данных для последующего моделирования производства. Используя Amber, изначально энергия сводит к минимуму систему моделирования, чтобы обойти любые неблагоприятные конфигурации. В файле минимизации ввода отрегулируйте максимальную переменную цикла для общего цикла минимизации и количество циклов, чтобы указать количество циклов для крутого алгоритма спуска.
Используйте переменную веса удерживающего устройства, чтобы применить удерживаемую силу на растворимые атомы, указанные параметром маски удерживающих устройств. Провести минимизацию в несколько шагов, постепенно снижая сдержанность применяется на растворимых атомов от 25 до 0 килокалорий на моль ангстрем квадрат, а затем использовать команду для запуска минимизации. Нагрейте систему в течение 100 пикосекунд от 0 до 300 Кельвин и использовать команды, чтобы установить 10 килокалорий молар на квадратный ангстрем сдержанность на растворимых атомов.
Затем используйте команду для выполнения отопления. Equilibrate системы в течение 900 пикосекунд под изотермальной изобарик ансамбль и установить девять ангстрем расстояние отсечения для дальнего электростатического взаимодействия, постепенно снизить растворимый атом сдержанность до 0,1 килокалории на моль ангстрем площади и завершить equilibration с безудержной пять наносекунд моделирования. Вы запустите уравнив с командой, как указано.
Отрегулируйте текст, чтобы производственное моделирование проводилось в течение 100 наносекунд, при этом конформации сохраняются каждые 10 пикосекунд, а затем запустите моделирование с командой, как указано. Чтобы визуализировать образец конформации во время моделирования киназы дикого типа и мутанта EGFR, откройте файлы топологии янтаря и соответствующие файлы траектории в Visual Molecular Dynamics. А используя удобные вторичные представления структуры, проанализируйте общую структурную динамику белков с записанной траектории.
Затем просмотрите конкретные взаимодействия между атомами и остатками интереса, такие как каталитически необходимый лизин 745-глутамат 762 соляной мост. Кроме того, сохраните несколько конформаций, отобранных во время моделирования в формате Protein Data Bank, и откройте конформации в Kymera. Используйте вариант свахи, чтобы наложить структуры на начальную или медианную структуру и отобразить медианную структуру в твердом, а остальные выровненные структуры в выцветших белых, чтобы позволить визуализацию записанных структурных движений с большей ясностью.
Проанализировать глобальную стабильность ЕГФР дикого типа и мутантов и изучить гибкость различных структурных единиц, импортировать типологию янтаря и соответствующие файлы траектории. В корневом среднем квадратном файле ввода отклонения укажите атомы позвоночника исходной структуры в качестве ссылки на корневую квадратную установку. В корневом среднем файле ввода квадратных колебаний укажите атомы C-альфа исходной структуры в качестве ссылки на корневую квадратную установку.
Затем запустите анализ с помощью программы CPPTRAJ и навести данные вывода. Кроме того, выровнять конформативные ансамбли и окрасить каждый остаток на основе корня атома C-альфа означает квадратное отклонение, открыть конформации в Kymera и выровнять их с вариантом свахи. Выберите инструменты, изображение и визуализацию по атрибуту.
Выберите остатки конформации ансамблей и установите корень C-альфа среднее квадратное отклонение в качестве атрибутов, а затем нажмите OK. Цепной след конформаций будет окрашен в синий, белый или красный цвета, отражающие области высокой, средней и низкой структурной стабильности соответственно. Для анализа взаимодействий водородных связей между АТФ и ЭГФР дикого типа и удаления подготовьтесь к сценарию CPPTRAJ для выполнения этой задачи. Укажите анализ для интермолекулярных водородных связей только с переменной ноинтрамол и определите водородную связь с расстоянием донора-приемора менее 3,5 ангстремов и углом связи больше или равен 135 градусам.
Для оценки внутримолекулярных взаимодействий, например, между каталитически важными остатками лизина и глутамата, укажите лизин в качестве донора водорода и глутамата в качестве остатков рецептора и запустите сценарий, как указано, чтобы позволить анализ результата. Чтобы вычислить связывающие свободные энергии между АТФ и как диким типом, так и удалением EGFR, подготовьте рецептор лиганда фазы газа и лигандовый рецепторный комплекс белковых файлов Банка данных в программе LEAP и установите АТФ в качестве лиганда и EGFR в качестве рецептора. Установите обобщенное родился радио значение M Бонд I2. Затем генерируйте топологию янтаря и координируйте файлы для файлов банка данных о газовой фазе Protein Data Bank.
Аналогичным образом, для расчета связывания свободных энергий между активатором и приемником киназы дикого типа и аланина 702 валиновых EGFRs, укажите приемник киназы как лиганд и активатор киназы в качестве рецептора и сохранить соответствующую топологию и координировать файлы. Подготовь молекулярную механику обобщенного файла ввода поверхностной поверхности и установите значение IGB до двух, а соляной - до 0,1. Затем с помощью mmpbsa.
скрипт, доступный в Amber, введите команду, как указано для выполнения связывающих энергетических вычислений и анализа выходных данных. Во время этого репрезентативного 100 наносекундного моделирования, аланин 702 валин мутант показал повышенную конформационную стабильность juxtamembrane B сегмента, вероятно, из-за ужесточения гидрофобных взаимодействий по сравнению с диким типом EGFR. Аланин 702 валин мутант также выставлены более низкой свободной энергии связывания между активатором и приемником киназы по отношению к дикого типа EGFR, представляющих более благоприятные димер взаимодействия, которые поддерживают активную конформацию EGFR киназы.
Моделирование мутации удаления привело к снижению колебаний атома С-альфа функционально ключевой альфа-C-спирали по сравнению с ЭГФР дикого типа, продлевая время активного состояния EGFR. Удаление мутации также привело к частому образованию водородных связей между боковой цепью полярных атомов лизина 745 и глутамата 762, ключевое взаимодействие для enzymatic деятельности EGFR по сравнению с диким типом EGFR. Кроме того, количество водородных связей между АТФ и EGFR было больше для удаления мутанта, чем для дикого типа EGFR.
Удаление мутации также привело к внутреннее движение EGFR неактивное состояние альфа-C-спирали, структурные изменения, ожидаемые во время перехода к активному государству. В отличие от этого, альфа-C-спираль неактивного EGFR дикого типа сохранила свою первоначальную конформацию. Для оценки воздействия мутаций крайне важно выбрать соответствующие конформационные состояния структур и правильно подготовить и уравночные эти структуры.
Важно сочетать молекулярно-динамическое моделирование с экспериментальными исследованиями, поскольку синергия между этими методами приносит пользу интерпретации результатов и может сообщить дополнительные влажные лабораторные эксперименты.
