Двойное электропорирование матки является мощным методом для изучения важных аспектов кортикогенеза млекопитающих, таких как взаимодействие между нейронными клетками, генерируемые в разных местах и возрастов развития. Основным преимуществом этого метода является способность быстро, детально и недорого изучить невозмутимые взаимодействия между этими различными популяциями клеток. Одним из поразительных последствий нашего метода является то, что он облегчает лучшее понимание того, как аналогичные наши проводки изменяется в нейрональных расстройств, как аутизм и шизофрения.
Это исследование не ограничивается неокортекс, но он также может быть использован для анализа взаимодействия клеток с клетками, в областях экзокортико, таких как сепалий или мозжечок. Одним из наиболее сложных шагов является инъекция ДНК в боковой желудочков ранних эмбрионов. Использование источника яркого света имеет важное значение для успешных инъекций.
Для каждой операции сначала подготовить 10 микролитров решение, содержащее один микролитер быстрого зеленого красителя, один микрограмм на микролитер плазмидной ДНК решение интерес для каждой плазмиды, и соответствующий объем на эндотоксин бесплатно TE буфера. И предварительно загрузить стеклянную микрокапильярию пипеткой с соответствующим подготовленным раствором ДНК. Для первого в хирургии электропорации матки, применять мазь на глазах надлежащим образом приуротил анестезии беременной мыши, и использовать бритву для бритья живота.
Дезинфицировать обезвемую кожу два раза с последовательными 70% этанола и йода салфетки, прежде чем приступить к разрезу на правой стороне живота. После того, как матка доступна использовать кольцо типсы тщательно извлечь орган. Используя трубку аспиратора с контролем рта, ввимите приблизительно 0,5 микролитров раствора в боковой желудочек левого полушария эмбрионов E11.5 для стратегии A.Or в боковой желудочек правого полушария эмбрионов E13.5 для стратегии B, пока быстрый зеленый краситель не будет виден внутри желудочка.
Когда все решение было введено, место force типа платиновых электродов боковой вокруг головы инъекционных эмбрионов, с положительным полюсом, ориентированным на медиальной стенки для целевой корковой подол для стратегии А, или ориентированы на боковой коры для стратегии B, заботясь, чтобы избежать сердца и плаценты. Используйте квадратный волновой электропоротер для применения соответствующей последовательности электрических импульсов для каждого эмбрионального возраста, как указано в таблице. Когда все эмбрионы были введены и электропотери, используйте типсы, чтобы тщательно вернуть матку в брюшную полость, и заполнить живот теплым солевым раствором.
Используя иглу 6-0 шва, закрыть брюшную стенку, и тщательно закрыть разрез кожи. Затем верните животное в свою домашнюю клетку с наблюдением до полного выздоровления. Через два дня после первоначальной операции, подтвердить, что мышь проявляет нормальное поведение, и не представляет никаких признаков боли или бедствия.
Перед подготовкой животного ко второму в утробе матери электропорации, как только что продемонстрировано. Введать 0,5 микролитров желаемого раствора ДНК в левый боковой желудочек мозга эмбрионов E13.5 для стратегии А, а также в левый боковой желудочек головного мозга эмбрионов E15.5 для стратегии B.After каждой инъекции, поместите электроды с положительным полюсом, ориентированным на боковой коры инъекционного полушария для стратегии А и стратегии B.And электропоратных эмбрионов, как указано в таблице. Когда электропорация закончена, верните матку в брюшную полость и завершите операцию и послеоперационную помощь, как это было продемонстрировано.
При реализации стратегии А, через четыре дня после второго электропорации, урожай матки эмбрионального дня 17,5 беременных самок мыши в чашку Петри PBS на льду. И использовать пинцет для передачи эмбрионов в новое блюдо PBS под рассечением микроскопа. Используя миппы, тщательно схватить голову каждого эмбриона, чтобы облегчить удаление кожи над головой и черепом.
Используйте типсы или шпатель, чтобы снять открытые мозги. Затем используйте ложку, чтобы перенести каждый мозг в отдельные колодцы 48 хорошо пластины, содержащей около 600 микролитров фиксаторного раствора на скважину. Когда все мозги были собраны, исправить мозг на четыре градуса по Цельсию ночь на орбитальной шейкер, а затем три десять минут моет в PBS.
После последней стирки, вставлять мозг в 4%low точки плавления агарозы в PBS в течение примерно десяти минут. После того, как агароза затвердевла, используйте клей цианоакрилата, чтобы обеспечить каждый мозг вибратомной ткани держателя обонятельной луковицы вверх. Поместите держатель внутри вибромного контейнера и заполните контейнер PBS.
Затем используйте вибром и кисть, чтобы получить 100 микрометров толщиной корональных серийных секций. Передача до семи секций на скважину и шесть скважин на эмбрион, в новой пластине 48 скважин, содержащей 600 микролитров на колодец свежего PBS, дополненный противогрибковых консервантов, как они собираются. Когда все разделы были приобретены, используйте тонкую кисть, чтобы смонтировать каждый раздел на слайде стеклянный микроскоп, и покрыть их стеклянной крышкой для оценки эффективности электропорации на вертикальном эпифлюоресценции микроскопа.
При реализации стратегии B, на послеродовой день 15, после подтверждения отсутствия ответа на topinch, обеспечить мышь в положении на спине, и использовать ножницы, чтобы сделать разрез средней линии кожи подвергать грудной клетки и диафрагмы, и сократить диафрагму, чтобы получить доступ к сердцу. Используя тонкие ножницы, сделать разрез в правом атриуме, и использовать 25 гейдж иглы подключены к гибкой трубки перистальтического перфузионного насоса, чтобы проникнуть в левый желудочек. Когда игла на месте, доставить по крайней мере 25 миллилитров 4%paraformaldehyde транскардиальной перфузии, при постоянном потоке на 5,5 миллилитров в минуту.
Примерно через пять минут, остановить перфузии, и использовать ножницы, чтобы удалить кожу над головой. Удалить череп, и использовать шпатель для удаления ткани мозга. Поместите мозг в один колодец из 24 пластины, содержащей 1,5 миллилитров свежего 4%paraformaldehyde, для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию на орбитальном шейкере.
Затем приобрети 40 микрометровых участков послеродового мозга, как только что продемонстрировано. Для эмбриональной и послеродовой визуализации мозга поместите слайды, содержащие установленные секции мозга, представляющие интерес, на держатель слайда микроскопа. Введи держатель ползунка в конфокальный микроскоп и выберите подходящий канал для фторфоров, используемых в эксперименте.
Выполните сканирование образца, чтобы получить картографический образец каждой секции мозга на двух разных длинах волн для общего представления о двойном выходе электропорации. После завершения, выберите 10x объектив, в многопрофильном режиме наблюдения промежуток времени. В каждом из выбранных областей XY устанавливаются соответствующие периметры изображения, а также глубина сканирования вдоль оси q в соответствии с плоскостями образца, в котором видна флуоресценция.
Получить изображения с низким увеличением всех выбранных регионов, а также экспортировать изображения из формата OIF в формат TIFF в микроскоп просмотра программного обеспечения. Затем выберите 60x объектив, и захватить высокое увеличение изображения, как только что продемонстрировали, чтобы наблюдать ячейки к клетке взаимодействия на более подробном уровне. Временной разрыв между двойным в операциях по удалению утери позволяет торезиальным клеткам CAG, нацеленным на эмбриональный день 11.5 в одном из мест его происхождения, достичь маргинальной зоны бокового неокортекса, включая соматосенсную область, вовремя установить контакты с корковыми проекционными нейронами, помеченными в эмбриональный день 13.5.
Ведущие процессы проекционных нейронов, выражающие усиленную GFP, обильно усиливаются в маргинальной зоне коры головного мозга и смешиваются с процессами M-вишневого выражения катарецких клеток. В утробе матери электропорации в эмбриональный день 13,5, используя BFP, выражаюющий плазмиду облегчает маркировку проекционных нейронов через различные корковые слои. Второе электропорирование в контралатеральной стороне эмбрионального дня 15.5 нацелено на верхний слой каллозаальной проекции нейронов субпопуляции, но не нижнего слоя проекционных нейронов, которые развиваются на более ранних стадиях.
Верхний слой целевых нейронов расширить свои аксоны в контралатеральное полушарие, с характерной схемой арборизации. Высокое увеличение позволяет более детально визуализировать каллосал аксон иннервации целевых проекционных нейронов в контралатеральной полушарии. При попытке этого протокола, важно планировать электропорации сроки, полушария вводить, и положение электродов в зависимости от популяций клеток, которые будут направлены.
После этой процедуры все методы, такие как электропорация является интересным. Для обоих типов клеток могут быть выполнены для изучения возможных изменений цепи in vivo. Используя этот метод, можно изучить тонкое взаимодействие между двумя различными целевыми клетками.
Включая новую научную информацию in vivo, путем электропорации флуоресцентных синаптических белков.
