Наш протокол позволяет детально идентифицировать и анализ моноцитов и макрофагов и Т-клеток и их соответствующих подмножений в нейронах и яйцеклетках и различных других тканях иммунной системы. Наша методика облегчает надежный урожай иммунных клеток жизни из синовия и других соответствующих тканей для всесторонней характеристики остеоартритического иммунного ответа. Для изоляции тканей, представляющих интерес от остеоартрита модели мыши, с мышью в положении на спине, протрите грудь, живот и ноги 70% этанола.
Используйте ножницы, чтобы тщательно открыть кожу вдоль средней линии живота, оставляя брюшную полость нетронутой. И осторожно вытяните кожу на правую сторону животного от основной мышцы, оставляя подкожной жировой ткани прилагается к коже. Поместите мышь под рассечение микроскопа и использовать два изогнутых тонких типсов, чтобы мягко дразнить из жировой ткани, расположенной на бедре.
После выявления трех перекрестных сосудов, используйте тонкое рассечение типсов для удаления пахового лимфатического узла, расположенного на пересечении сосудов, заботясь о том, чтобы не разорвать капсулу. Используйте типсы, чтобы удалить оставшийся жир с поверхности лимфатического узла и открыть брюшную полость. Если не осталось жира можно увидеть, поместите лимфатический узел сразу в ранее подготовленных и помечены шесть хорошо пластины заполнены 0,5 миллилитров RPMI средств массовой информации.
После этого откройте брюшную полость. Используйте тонкие ножницы, чтобы вырезать селезенку и аккуратно извлечь кишечник, чтобы разоблачить аорту и ее бифуркацию. В дальнейшем, поместите селезенку сразу в ранее подготовленных и помечены шесть хорошо играл заполнены 0,5 миллилитров RPMI средств массовой информации.
Удалите подвздошный лимфатический узел, расположенный в терминальной части брюшной аорты и происхождение общей подвздошной артерии и тщательно удалить кожу с обеих задних конечностей. Немедленно поместите лимфатический узел в ранее подготовленные и помечены шесть хорошо пластины построить с 0,5 миллилитров RPMI средств массовой информации объединения всех лимфатических узлов от двух животных. Используя тонкие ножницы или скальпель очистить левую бедренную кость прилагается мышечной ткани и тщательно отключены как задушить и тазобедренного сустава, в результате чего вся кость нетронутыми при удалении бедренной кости.
Затем поместили бедренную кость в ранее подготовленную и помеченную шесть хорошо пластин, наполненных 0,5 миллилитров RPMI сми. Определите сухожилие коленной чашечки правого подавления сустава и использовать тонкие ножницы, чтобы удалить прилегающую мышечную ткань проксимальной к суставу до тех пор, пока примерно пять миллилитров четырехглавой сухожилия проксимальной коленной чашечки подвергаются. Прорезать четырехглавое сухожилие примерно три-четыре миллиметра проксимальной для коленной чашечки, чтобы сформировать ручку и использовать тонкие типсы, чтобы мягко вытащить напряжение от сустава, чтобы разоблачить края совместного крепления капсулы.
Начиная с бедренной кости и двигаясь к голени, используйте скальпель, чтобы тщательно сократить по краям совместной капсулы с обеих сторон, сохраняя при этом нежную тягу на четырехглавом сухожилии. Когда блок синовиальной ткани крепится только к голени, внутрисударная жировая прокладка должна быть хорошо видна дистальной к коленной чашечке и может быть мягко отделена от сустава и передней стороны Минского. Затем разрежьте вдоль оставшейся части суставной капсулы, чтобы удалить синовиальный блок ткани и сразу же поместите его в предварительно подготовленную и помеченную шесть хорошо пластин, наполненных 1,5 миллилитров RPMI media.
Когда все ткани были собраны, место двух объединились селезенки в состоянии на 70 микрометровых клеток ситечко в 15 миллилитров трубки и использовать стерильные три миллилитров шприц поршень мягко скорость тканей через сетчатый фильтр промывки ситечко часто в общей сложности шесть миллилитров RPMI 1640 средних дополнены 10% FBS. Осадок клеток центрифугации, и повторно приостановить гранулы в пяти миллилитров красных кровяных клеток лиза фугу. Через пять минут прекратите реакцию с помощью 10 миллилитров PBS и центрифуги клеток.
Когда больше не наблюдаются эритроциты, повторно приостанавливайте гранулы в одном миллилитре свежего PBS для подсчета. Для обработки лимфатических узлов место все четыре лимфатических узлов на 70 микрометровых клеток ситечко в новой 15 миллилитровой трубки и использовать новый стерильный три миллилитров поршень мягко дразнить лимфатических узлов через сетку в одноклеточной подвески, а затем центрифуги клетки в 500 раз G в течение пяти минут, отказаться от супернатантных и повторно приостановить гранулы в 500 микролитров PBS для подсчета. Чтобы изолировать костный мозг, используйте ткани миг большого пальца, чтобы тщательно понять нетронутыми бедренной кости и использовать острые ножницы, чтобы отрезать самый конец проксимальной бедренной кости.
Вставьте 23 калибровочной иглы в середине межкордилярной выемки бедренной кости и поверните иглу при применении мягкого давления, чтобы просверлить отверстие в выемку. Изменяя иглу по мере необходимости, промыть содержимое кости с шестью миллилитров RPMI дополнены 10%FBS на 70 микрометровых клеток ситечко на новой 15 миллилитровой трубки и использовать новый три миллилитровый шприц поршень мягко нажмите костного мозга через сетку. После этого выполните шаг РБК, как это было продемонстрировано для селезенки.
Когда больше не наблюдаются эритроциты, повторно приостанавливайте гранулы в одном миллилитре свежего PBS для подсчета. Для обработки синовиальной ткани используйте тонкие хирургические ножницы, чтобы нарезать кости двух блоков синовиальной ткани на мелкие кусочки и перенести образцы в новую 15 миллилитровую трубку. Промыть контейнер для сбора с 500 микролитров среды для сбора оставшихся клеток и синовиальных тканей и вытащить мыть в трубку сбора образцов.
Затем добавьте достаточный объем фермента, чтобы достичь в одной единице на миллилитр конечной концентрации и переварить образец синовиальной ткани при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе в течение двух часов ротатора. Обеспечь достаточное движение при размещении трубок в ротаторе. В конце инкубации, остановить пищеварение с восемью миллилитров RPMI дополнены 10%FBS и фильтровать подвеску клетки через 70 микрометровый ситечко клеток в новую 15 миллилитровую трубку.
Промыть старую 15 миллилитровую трубку с пятью миллилитров среднего и использовать это для мытья фильтра. Затем осадок клеток центрифугации и повторного перерасхода гранул в 500 микролитров PBS для подсчета. Для выполнения жизнеспособности окрашивания изолированных иммунных клеток, добавить пять раз 10 к пяти клеткам каждой клетки подвески в соответствующие скважины двух различных 96 хорошо U-нижней пластины и собирать клетки на дно каждой скважины.
Всегда включать достаточно необличенных клеток каждого типа ткани в качестве отрицательного контроля. Вымойте клетки с 200 микролитров PBS и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров клеток в проницаемый амин реактивный краситель на колодец в течение 15 минут инкубации при четырех градусах цельсия защищены от света. В конце инкубации мыть клетки два раза в 200 микролитров буфера FACS на стирку и повторно приостановить каждую гранулу в 100 микролитров соответствующих антител интересов или контроля коктейль.
Если как внутриклеточное, так и внеклеточное окрашивание проводится в одном и том же выполняют внеклеточный шаг окрашивания сейчас. После 30-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия защищены от света мыть клетки два раза с 200 микролитров буфера FACS на колодец и повторно приостановить клетки и моноцитов подмножество панели пластины в 250 микролитров буфера FACS дополнены одним миллимолярной EDTA. Проведите этот шаг только в том случае, если не планируется внутриклеточное окрашивание, в противном случае перейти к внутриклеточному окрашивания аспект протокола.
Затем перенесите каждый подмножество моноцитов в соответствующую трубку FACS на льду, защищенном от света. Для межклеточного окрашивания клеток подмножества Т-клеток повторно приостанавливайте гранулы в 200 микролитров буфера фиксации от соответствующей комплекта фиксации и пермялизации для 40-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. В конце инкубации мыть клетки два раза с 200 микролитров пермяки проницаемой мыть буфера и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров соответствующих антител интереса или контроль коктейль для 40 минут инкубации при четырех градусах Цельсия защищены от света.
Затем, мыть клетки два раза в 200 микролитров пермяки мыть буфер на стирку. И повторно приостановить клетки в 250 микролитров FACS плюс буфер EDTA перед передачей образцов в соответствующие facS трубки на льду защищены от света. Здесь можно наблюдать иерархическую стратегию закрытых для моноцитов подмножество панели на иммунных клетках, собранных из костного мозга обработанных ДММ животных.
Необлитаемые тролли могут быть использованы для определения истинных негативов для мертвого живого пятна и ворота могут быть скорректированы каждый раз, когда эксперимент проводится по мере необходимости. В этом репрезентативном анализе иммунные клетки были выделены из синовиальных тканей и окрашены внеклеточными маркерами поверхности, через шесть недель после операции по контролю DMM или фиктивного контроля. Более высокий процент Ly-SC положительные MHC2 отрицательные и M2 макрофаги наблюдаются в DMM обработанных животных по сравнению с популяциями клеток наблюдается в фиктивных мышей хирургии.
Здесь можно наблюдать иерархическую стратегию закрытости для дополнительной и внутриклеточной Т-клеточной панели на иммунных клетках, изолированных от селезенки обработанных ДММ животных. Более высокий процент клеток TH1 наблюдается в лимфатических узлах и синовиальных тканях DMM животных, а также большее количество Т-регуляторных клеток и клеток TH17. Для обеспечения получения высококачественных образцов, ткани должны быть собраны в быстрой, тщательной и последовательной основе.
После того, как иммунные клетки были изолированы, другие вниз по течению анализ может быть проведен, таких как RTPCR, клеточной культуры и отдыха на крови, чтобы пролить свет на молекулярные процессы, представляющие интерес.
