骨关节炎模型中骨髓、骨髓、淋巴结和合成组织内免疫细胞子集的流动细胞测量分析

我们的协议能够详细识别和分析单细胞和巨噬细胞和T细胞及其相关的子集内的神经元和卵巢和各种其他组织的免疫系统。我们的技术有助于从合成器和其他相关组织中可靠地收获生命免疫细胞，以便全面描述骨关节炎免疫反应。对于从骨关节炎模型小鼠分离感兴趣的组织，用鼠标在超活位置，用70%乙醇擦拭胸部、腹部和腿部。

使用剪刀小心地打开腹部中线的皮肤，同时保持腹腔完好无损。轻轻地将动物右侧的皮肤从底层肌肉中拉离，使皮下脂肪组织附着在皮肤上。将鼠标放在解剖显微镜下，使用两个弯曲的细钳轻轻梳理出位于大腿上的脂肪组织。

识别出三个交叉血管后，使用精细解剖钳子去除位于血管交汇处的内结淋巴结，注意不要破裂胶囊。使用钳子从淋巴结表面去除剩余的脂肪，并打开腹腔。如果无法看到剩余的脂肪，请立即将淋巴结放在先前准备的六个井板中，并标有 0.5 毫升的 RPMI 介质。

此后，打开腹腔。使用细剪刀切除脾脏，轻轻提取肠道，露出大阳高及其分叉。此后，立即将脾脏放在先前准备的六个播放良好、充满 0.5 毫升 RPMI 介质的标记中。

切除位于腹部主动脉终端段的伊利亚克淋巴结和常见腹腔动脉的起源，并小心地从两个后肢上去除皮肤。立即将淋巴结放在先前准备的六井板中，并标有 0.5 毫升的 RPMI 介质，将来自两个动物的所有淋巴结集中。使用细剪刀或手术刀清洁附着肌肉组织的左股骨，并小心地断开窒息和臀部关节，使整个骨骼完好无损，同时去除股骨。

然后将股骨放在先前准备的六个井板中，并加注了 0.5 毫升的 RPMI 介质。识别右侧扼杀关节的肌腱，并使用细剪刀将相邻的肌肉组织近到关节，直到约五毫升的四头肌肌腱近向关节暴露。切开四头肌肌腱约三到四毫米近到帕泰拉形成一个手柄，并使用细钳轻轻地拉开关节的张力，以暴露关节胶囊附件的边缘。

从股骨开始，向头骨移动，使用手术刀小心地沿着两侧的关节胶囊的边缘切割，同时保持四头肌肌腱的温和牵引力。当突触组织块仅附着在头骨上时，关节内脂肪垫应清晰可见，并且可以轻轻地与明斯基的关节和前部分离。然后，沿着关节胶囊的剩余部分切割，取出突触组织块，并立即将其放在先前准备的六井板中，并加注了1.5毫升的RPMI介质。

收集所有组织后，将每个条件的两个池状的池状物放在 15 毫升管中的 70 微米细胞过滤器上，并使用无菌的 3 毫升注射器柱塞通过网状过滤器频繁冲洗应变器，总共用 10%FBS 补充 6 毫升的 RPMI 1640 介质。通过离心沉淀细胞，并在五毫升红血球解泡河豚中重新悬浮颗粒。五分钟后，停止与10毫升PBS的反应，并离心机。

当不再观察到红血球时，将颗粒重新悬浮在一毫升新鲜PBS中进行计数。对于淋巴结处理，将所有四个淋巴结放在一个新的15毫升管中的70微米细胞过滤器上，并使用新的无菌三毫升柱塞通过网格轻轻戏弄淋巴结到单个细胞悬浮液中，然后以500次G离心细胞5分钟，丢弃上清液，并在500微升PBS中重新悬浮颗粒进行计数。要分离骨髓，请使用组织拇指钳小心地抓住完整的股骨，并使用锋利的剪刀切断近端股骨的端。

将 23 测量针插入股骨的凹槽中间，旋转针头，同时施加温和压力，将孔钻入凹口。必要时更换针头，用六毫升的 RPMI 将骨内容物冲洗，并辅以 10%FBS，将骨质填充剂冲洗到新的 15 毫升管上的 70 微米细胞过滤器上，并使用新的 3 毫升注射器柱塞轻轻按压骨髓通过网。此后，执行 RBC 步骤，如脾脏所证明的。

当不再观察到红血球时，将颗粒重新悬浮在一毫升新鲜PBS中进行计数。对于合成组织的处理，使用精细的手术剪刀将两个突触组织块切成小块，将样品转移到新的15毫升管中。用500微升的介质冲洗收集容器，收集剩余的细胞和合成组织，并在样品收集管中拉洗。

接下来，加入足够量的酶，以达到每毫升一个单位的最终浓度，并在37摄氏度的培养箱中消化突触组织样本，在旋转器中消化两个小时。将管子放在旋转器中时，确保有足够的运动。在孵育结束时，停止消化与8毫升的RPMI补充10%FBS，并通过70微米细胞过滤器过滤细胞悬浮液到一个新的15毫升管。

用五毫升的介质冲洗旧的 15 毫升管，然后用它来清洗过滤器。然后，通过离心沉淀细胞，将颗粒重新悬浮在500微升PBS中进行计数。为了对分离的免疫细胞进行生存能力染色，将五倍10添加到每个细胞悬浮液的五个细胞中，加入到两个不同的96孔U底板的适当孔中，并将细胞收集到每个孔的底部。

始终将每种组织类型的足够未污染细胞作为负对联。用200微升PBS洗涤细胞，并在每井渗透胺反应染料中重新悬浮100微升细胞中的颗粒，在4摄氏度下孵育15分钟，不受光线影响。在孵育结束时，每次洗涤时用200微升的FACS缓冲液洗两次细胞，并在100微升的适当抗体或控制鸡尾酒中重新悬浮每个颗粒。

如果同时进行细胞内和细胞外染色，现在执行细胞外染色步骤。在4摄氏度下孵育30分钟后，每井用200微升的FACS缓冲液两次清洗细胞，并在250微升的FACS缓冲液中重新悬浮细胞和单细胞子板，并辅以1毫摩尔EDTA。仅计划未计划细胞内染色时执行此步骤，否则将转到协议的细胞内染色方面。

然后，将每个单细胞子集样品转移到适当的相应的 FACS 管中，防止光线。对于T细胞子板细胞的细胞间染色，从适当的固定和渗透试剂盒中重新悬浮200微升固定缓冲液中的颗粒，在4摄氏度下孵育40分钟，不受光线影响。在孵育结束时，用200微升的渗透洗涤缓冲液两次清洗细胞，并在100微升的适当抗体或控制鸡尾酒的100微升中重新悬浮，在4摄氏度的高温下进行40分钟的孵育。

然后，每次洗涤用200微升的渗透洗涤缓冲液洗两次细胞。在将样品转移到适当的FACS管中防止光线扩散之前，将250微升的FACS和EDTA缓冲液中的细胞重新悬浮。在这里，可以观察到从DMM治疗动物骨髓收集的免疫细胞上单细胞子集面板的分层浇注策略。

未染色的巨魔可用于确定活活死亡污渍的真实底片，并且每次根据需要进行实验时，都可以调整门。在这个具有代表性的分析中，免疫细胞从突触组织分离，并在DMM或假对照手术六周后被染色，并染上细胞外表面标记。与在假手术小鼠中观察到的细胞数量相比，在DMM治疗的动物中观察到的Ly-SC阳性MHC2阴性及M2巨噬细胞的百分比较高。

在这里，可以观察到从DMM治疗动物脾脏分离的免疫细胞上额外和细胞内T细胞面板的分层浇注策略。在DMM动物的淋巴结和突触组织中观察到的TH1细胞比例较高，T调节细胞和TH17细胞的数量也较高。为了确保获得高质量的样品，必须迅速、细致和一致地采集组织。

一旦免疫细胞被分离，其他下游分析可以进行，如RTPCR，细胞培养和休息在血液中，以照亮感兴趣的分子过程。