Препарат флуоресцентных антибиотиков позволяет оценить локализацию этих терапевтических реагентов в бактериях с помощью удобных аналитических методов, таких как спектрофотометрия и микроскопия. Основным преимуществом этого метода является легкость, с которой можно определить локализацию антибиотиков. Эта локализация имеет отношение к ряду явлений, включая эффлюкс.
Для выполнения процедуры реакции щелчка А поместите антибиотик азида, представляющий интерес, в круглую нижнюю колбу и добавьте в колбу 25 миллилитров терт-бутанола и 25 миллилитров воды на миллимоле азида. Добавьте подготовленный флюорофор алкин к раствору и нагрейте реакцию до 50 градусов по Цельсию. Затем добавьте в колбу 0,6 эквивалента сульфата меди и 2,4 эквивалента аскорбиновой кислоты.
Перемешайте реакцию в течение одного часа или до тех пор, пока анализ LCMS не укажет на завершение реакции. Затем охладить и очистить реакцию, как это уместно для антибиотика эшафот. Здесь показана ключевая химическая реакция на подготовку флуоресцентных антибиотиков с примерами структуры, синтезированной из соответствующих антибиотиков с помощью промежуточного азида на основе ципрофлоксацина, линезолида и триметоприма.
В этих жидких хроматографии масс-спектрометрии следы ципрофлоксацина азида и NBD alkyne нажмите реакции, азид был eluted на 3,2 минуты, и продукт был eluted на 3,8 минуты. За ходом реакции клика может последовать исчезновение пика азида. В этих спектрах влияние очищения можно визуализировать с исчезновением ошибочных пиков.
Для оценки противомикробной активности синтезированного антибиотика, полоса глицерола запасы бактериальных штаммов, подходящих для антибиотика эшафот на пластины LB агар и расти культуры ночь на 37 градусов по Цельсию. На следующее утро, выбрать одну колонию из каждой пластины и культуры колоний ночь в пять миллилитров CAMHB на культуру при 37 градусов по Цельсию. На следующий день разбавляют культуры примерно в 40 раз свежим CAMHB и выращивают бактерии до середины фазы журнала с оптической плотностью на 600 нанометров между 0,4 и 0,8.
Далее, подготовить фондовые растворы каждого флуоресцентного антибиотика на 1,28 миллиграмма на миллилитр в 20% диметилового сульфоксида в стерильной воде и добавить 10 микролитров антибиотиков в каждый колодец первой колонки 96-хорошо пластины. Добавьте 90 микролитров CAMHB к каждой скважине первой колонны и 50 микролитров ко всем другим скважинам. Затем выполните серийное двухкратное разбавление по всей тарелке.
После тщательного смешивания, разбавить середине культуры фазы журнала примерно в один раз 10 до шестой колонии формирования единиц на миллилитр и добавить 50 микролитров каждой культуры для разбавления скважин, чтобы получить окончательную концентрацию примерно в пять раз 10 до пятой колонии формирования единиц на миллилитр. Когда все бактерии были покроеные, поместите крышки на пластины и инкубировать культур в течение 18 до 24 часов при 37 градусов по Цельсию без встряхивания. На следующий день визуально осмотрите пластины.
Минимальная концентрация торможения будет самой низкой концентрацией хорошо без видимого роста. Для анализа накопления зонда, полоса глицерола запасов бактериальных штаммов на пластины LB агар для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию. На следующее утро выберите одну колонию из тарелки для ночной культуры в лисогенном бульоне при 37 градусах по Цельсию.
На следующее утро разбавляют ночную культуру примерно в 50 раз свежей средой. Когда культура достигает средней фазы журнала, гранулы бактерий центрифугации и декантировать среды. Resuspend бактерий в один миллилитр PBS и центрифуги бактерий снова.
Декант supernatant и resuspend промытые гранулы в PBS к оптической плотности на 600 нанометров 2. Добавьте 10,1 микролитров 10 миллимолярной CCCP в PBS в один миллилитр бактерий и инкубировать бактерии при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. В конце инкубации, собирать бактерии центрифугации и повторно гранулы в один миллилитр от 10 до 100 микромолесцентных флуоресцентных антибиотиков в PBS.
После 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия, мыть клетки центрифугации четыре раза в один миллилитр холодного PBS за стирку. После мытья вынизываете бактерии 180 микролитров буфера лиза и 70 микролитров лизозима. Через 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию, заморозить-оттепели бактерий три раза при минус 78 градусов по Цельсию в течение пяти минут и 34 градусов по Цельсию в течение 15 минут соответственно.
После последнего раунда замораживания оттаивания, sonicate образца в течение 20 минут, а затем 30 минут инкубации при 65 градусов по Цельсию. В конце инкубации соберите облицованные образцы путем центрифугации и процедите содержимое трубки через 10 килодальтонную фильтровальную мембрану. Вымойте фильтр четыре раза с 100 микролитров воды на стирку и aliquot каждый мыть в отдельных колодцев из черной плоской нижней 96-хорошо пластины.
Затем измерьте интенсивность флуоресценции на считыватель пластины с возбуждением и выбросами длин волн, соответствующих флюорофору. Эти типичные результаты оценки внутриклеточного накопления с помощью флуоресцентной спектроскопии в присутствии и отсутствии эффлюкса показывают, что внутриклеточная флуоресценция бактерий значительно выше после предварительного лечения CCCP, указывая, что эффлюкс уменьшает накопление внутри бактерий. В этих репрезентативных конфокальных микроскопии изображения Грам положительные и Грам отрицательных бактерий, локализация антибиотика в бактериях могут быть визуализированы после лечения CCCP.
Это явление не наблюдается, когда не добавляется CCCP. При использовании флуоресцентных антибиотиков, помните, какую информацию вы стремитесь собрать и не забудьте рассмотреть, какой протокол будет наиболее полезным при получении этих данных. После их синтеза флуоресцентные антибиотики могут быть использованы для изучения ряда бактериальных процессов, включая лекарственные целевые взаимодействия и модификации резистентности.
