Плазмиды являются экстрахромосомными элементами, которые повсеместно распространены в большинстве видов бактерий и мест обитания, где они являются очень важными агентами боковой передачи генов, поскольку они могут мигрировать между клетками и между популяциями. Одним из наиболее ярких и ярких примеров такой передачи является распространение генов устойчивости к антибиотикам, которые кодируются на плазмидах. Чтобы построить модель плазмиды, которая кодирует ген устойчивости к антибиотикам, выберите плазмидную основу и ПЦР усиливают позвоночник с помощью полимеразы высокой точности и грунтовки, которые связываются на плазмидном шаблоне. В нашем случае мы использовали плазмидную основу pBBR1. Далее, усилить сопротивление гена nptII в том числе родной промоутер Tn5 с помощью полимеразы высокой точности. Дизайн грунтовки для гена сопротивления с примерно 20 базовых пар последовательности комплементарной плазмидной позвоночника. После ПЦР сплавьте гомологическую область очищенного гена ПЦР-продукта с очищенной плазмидной основой с помощью изотермальной сборки при 50 градусах в течение 60 минут. Превратите сплавленный продукт в E.Coli DH5-Alpha с помощью электропорации. Плита 100 микролитер смеси на селективных средств массовой информации и инкубировать при 37 градусов в течение 24 часов. Плазмида может быть извлечена, проверена и преобразована в штамм дикого типа E.coli MG1655. Это дает штамм MG1655 pCON.During воздействия антибиотиков, бактерии нуждаются в плазмиде, чтобы выжить. Таким образом, плазмида находится под положительным отбором. При не селективных условиях, поэтому без антибиотиков плазмида является одноразовой для клетки. Целью нашего исследования было следовать плазмиды в таких не избирательной условиях с течением времени. Для этого мы оснастили небольшие плазмиды геном устойчивости к антибиотикам и ввели его в кишечную палочку Эшерихия. Мы провели эволюционный эксперимент и наблюдали частоту плазмидов с помощью покрытия реплики. Плазмид, несущий штамм mg1655 pCON, теперь вводится в эксперимент эволюции. Во-первых, пластины mg1655 pCON на пластинах LB агар дополняется антибиотиками и инкубировать на ночь при 37 градусах. Из этой пластины случайным образом выбирают 8 колоний предков и инкубируют на ночь при 37 градусах с постоянной тряской. На следующий день популяции переносятся на эксперимент, который проводится в 96 глубоководных пластинах. Очень важно случайным образом распределить репликации по всей пластине. Например, в шахматном подходе. В нашем эксперименте культуры разбавляются и передаются с разной скоростью разбавления и при двух температурах. Во время каждого случая передачи применяется разбавляемость и серийная передача повторяется в общей сложности 98 переводов. В ходе эволюционного эксперимента частота плазмидов в популяции оценивается по доле плазмидных несущих клеток. Реплика покрытие было популяризировано Эстер и Джошуа Ледерберг в 1950-х годов, где они использовали его для изучения лекарственной устойчивости в бактериях. Метод позволит им высококлассные их сканирования фенотипов и в конце исследования показали, что устойчивость пенициллина может возникнуть у бактерий из-за спонтанных мутаций в геноме. Для определения плазмидной частоты в популяции в ходе эксперимента стационарные культуры последовательно разбавляются и помылись на не селективных агарных пластинах LB. Отрегулируйте разбавление в соответствии с выходом от 250 до 500 колоний на тарелку. Популяции с покрытием инкубированы для ночного роста при 37 градусах менее чем за 24 часа. Колонии лучше всего реплицировать, когда они еще маленькие. После ночного роста подсчитывают все колонии, используя автоматизированный счетчик колонии по выбору читателя. Это дает общий размер популяции бактерий в культурах. Обратите внимание, что колонии на краю пластины должны быть оставлены вне. Чтобы воспроизвести пластины, вам нужны селективные агарные пластины, дополненные антибиотиками, круглым блоком, металлическим кольцом, которое подходит блоку, и стерильной бархатной тканью. Ткань должна быть 100%хлопок, как это может быть стерилизована путем автоклавации. Поместите ткань на блок и исправить его с металлическим кольцом.Аккуратно поместите тарелку с подсчитанными колониями на фиксированную бархатную ткань поверхности. Нажмите на пластину кругов движениями так, чтобы вся поверхность пластины касался ткани. Очень важно, чтобы все колонии касались бархата. Снимите пластину LB и поместите селективную пластину на бархат. Повторите тщательное нажатие. Опять же важно, чтобы пластина полностью касался бархата. После этого удалите селективную пластину. Пластины инкубируется при комнатной температуре на ночь. На следующий день, как LB и антибиотики пластины необходимы для оценки. Поместите пластины друг над другом и сравнить рост. Вы можете легко обнаружить колонии свободных пространств. Это колонии, которые не устойчивы к антибиотикам. Таким образом, эти колонии потеряли плазмиду. В конце концов, отметь, сколько колоний не хватает на пластине антибиотиков. Это число дает вам потерю плазмиды. Повторяйте покрытие реплики всех популяций во время эксперимента эволюции еженедельно. Потеря плазмида может быть вызвана плазмидной мульти мальформацией. При работе над плазмидной конструкции сказать для выражения данного гена в вашем предпочтительном штамма хозяина родной поведение плазмидной in vivo в отношении подтверждения состояние может принять, как правило, то, что упускается из виду. Но в эволюционном контексте такое подтверждение изменений может иметь очень большое значение. Анализ плазмидных подтверждений может быть очень сложной задачей. Особенно плазмидные мультимеры трудно анализировать, потому что они не могут быть идентифицированы должным образом ПЦР или секвенированием. С другой стороны, плазмидные мультимеры трудно анализировать с помощью электрофорез геля из-за их потенциально больших размеров и их медленной электрофоретической подвижности. Наш протокол предлагает простой и простой метод для скрининга и идентификации плазмидных мультимеров, я бы сказал, любой данной плазмидной подготовки. Для визуальной плазмидной молекулы извлекают плазмиду из 5 мл стационарной ночной клеточной культуры с помощью щелочного лиза. Плазмидная экстракция плазмидов с низкой копией часто приводит к загрязнению хромосомной ДНК хозяина, которую необходимо переварить до визуализации. Для удаления хромосомного загрязнения ДНК обработать извлеченную плазмидную ДНК плазмидно-безопасной
