Техника отслеживания, описанная в этом протоколе, помогает нам изучать морфогенез нейронов и оснастки подключения в системе моторных нейронов Drosophila. Липофильные красители могут быстро рассеиваться в каждой части клеточной мембраны с чрезвычайно высокой плотностью. Вот почему наш протокол эффективно решает найти структуры помечены нейрона.
Если аксон терминал доступен с инъекцией micropipette, этот метод может быть применен к любому нейрону в личинок и взрослых стадиях мух или в других организмах. Если у вас нет опыта вскрытия или использования микроинъектора точной операции на образце, может быть сложной задачей. Понимание анатомии эмбриона, поможет с руководством к надлежащей порции инструментов для проведения вскрытия или dinjection.
Для начала подготовьте и расфасуйте все материалы для сбора эмбрионов. Подготовь фильтрационный аппарат, отрезав 50-миллилитровую трубку и разрезав отверстие в крышке. Затем установите сетчатый фильтр со 100 микрометровых пор между трубкой и крышкой.
Приготовьте микропипет для инъекций красителя и иглу для вскрытия из той же капиллярной трубки с внутренним диаметром 1,2 миллиметра. Потяните трубку с микропипетом, шкив на 7% от 170 вольт максимальный выход для создания острой иглы с конусом около 0,4 сантиметров в длину. Чтобы подготовить микропипет для инъекций красителя, замочите мясорубку с смачиванием и поместите иглу на зажим микропипюты при 25-30 градусах.
Затем опустите кончик на две трети радиуса из центра скошенной поверхности. Измельчить иглу в то время как шприц с трубкой толкает воздух в него. Отметте микропипет с тонкой наконечником постоянного маркера, чтобы указать положение отверстия на кончике после скошения, потому что это может быть сложной задачей, чтобы найти узкое отверстие, которое формируется под углом.
Разрешить мух откладывать яйца на ночь при комнатной температуре и собирать трубку с яйцами в первой половине дня. Для сбора эмбрионов, dechlorinate яйца на тарелке с 50% отбеливателя в течение пяти минут. После того, как хлорионы очистили, залить содержимое пластины через фильтрационный аппарат или клеточный ситечко, чтобы изолировать эмбрионы.
Используйте выжать бутылку воды, чтобы разбавить отбеливатель слева на тарелке и собрать как можно больше эмбрионов, как это возможно, декантирование смеси в фильтр. Вымойте эмбрионы три-четыре раза водой, пока запах отбеливателя рассеивается. Снимите фильтр с аппарата и вымойте его на другую чистую тарелку с водой.
Затем вы декант воды из новой пластины, что эмбрионы находятся на. Используйте тонкие типсы, чтобы выбрать от пяти до 10 эмбрионов в течение 15 часов после откладки яиц и поместить их на двустороннюю ленту с спинной стороны лицом вверх. Добавьте солевой раствор звона насекомых в бассейн для вскрытия, чтобы защитить эмбрионы от высыхания.
Используйте стеклянную иглу под микроскопом вскрытия, чтобы вытащить эмбрион из средней мембраны из ленты на стекло, заботясь, чтобы не повредить внутренние ткани эмбриона. Затем прорезать середину линии одного эмбриона на его поверхности от задней до передней части. Переверните эпителиальные ткани из центра и прикрепите эпидермальный край на поверхность стеклянной горки.
Используйте трубку подключен иглы с кончиком открытия около 300 микрометров, чтобы аспирировать или дуть воздух, чтобы удалить спинной продольной трахеи стволов, а также любые оставшиеся кишки. Используйте 4%PFA и PBS, чтобы исправить эмбрионы в течение пяти минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Затем мыть их три раза с PBS.
Пятно эмбрионов с одним микролитером анти хрена пероксидазы антител, конъюгированных с красителем Cyanine3 и 200 микролитров PBS в течение одного часа на орбитальном шейкере. И повторите моет в PBS. Чтобы заполнить инъекцию micropipette, поместите его в капиллярный держатель.
Затем поместите слайд красителя на сцену и используйте микроманипулятор, чтобы распоят его над слайдом. Затем отрегулируйте сцену, чтобы поместить микропипюту на краситель. Соберите краситель в микропипете, установив давление впрыска между 200 и 500 гектопаскаль, время впрыска между 0,1 и 0,5 секунды и компенсационные давления до нуля в течение пяти минут.
После того, как краситель был собран, удалите слайд красителя и поместите образец на стадии микроскопа. Затем увеличьте компенсациое давление до диапазона от 30 до 60 гектопаскалей и опустите микропипет в образец. Используйте объектив 10 раз, чтобы найти эмбрион и выровнять микропипюту с эмбрионом.
Измените объектив цели на погружение в воду в 40 раз объектив. И погрузи объектив в PBS. Используйте флуоресцентную микроскопию, чтобы проверить нейронную морфологию, отмеченную анти-HRP Cy3, и определить место инъекции.
Когда эмбрион находится в фокусе изменить положение микропипета, чтобы сделать нежный контакт с кончиком аксона интереса. Затем используйте яркую микроскопию поля во время инъекции, чтобы увидеть капли красителя. Бросьте краситель в правой брюшной гемисегации на нервно-мышечном стыке ACC или RP3 либо с DiD или DiO.
Используйте ручной контроль, чтобы освободить красителя и удалить микропипют. Затем перейти к следующему месту инъекции. Инкубировать образец в течение одного часа при комнатной температуре на орбитальном шейкере перед визуализацией.
Используя тонкие типсы, удалите ленты со стеклянной горки. Чтобы смонтировать образец, подготовьте крышку скольжения с небольшим количеством вакуумной смазки на четырех углах. Аккуратно помещайте его на образец, убедившись, что избежать пузырьков воздуха.
Нажмите вниз крышку скольжения, чтобы настроить пространство из образца для позволяя рабочее расстояние между объективом цели и слайд. Удалите излишки PBS с помощью салфеток задач. Полностью запечатать края крышки скольжения с лаком для ногтей.
Изображение в 10 раз и 100 раз больше с конфокального микроскопа и обрабатывать изображения, с программным обеспечением imageJ. Этот протокол был использован для ретроградной этикетки ACC двигатель нейрона иннерватирования мышцы один и RP3 двигатель нейронов иннерватных мышц шесть и семь. Дендритные ветви моторных нейронов АКК и RP3 имеют обширное перекрытие.
Оба нейрона являются биполярными, создание двух различных популяций дендритов. Чтобы продемонстрировать количественные возможности этого метода, общее количество кончиков дендрита было подсчитано в диком типе и мутантах Dscam1. Ипсилатеральные дендриты aCC показаны для дикого типа, но несколько ипсилатеральных дендритов наблюдались для мутанта Dscam1.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что размер капли красителя имеет решающее значение, которое составляет примерно от 10 до 20 микрометров. Проверьте размер на двухсторонней ленте, а затем применить его к месту инъекции. Используя эту процедуру, мы можем воспользоваться фото переключаемым свойством зонда DiD для получения изображений супер разрешения плазменной мембраны.
Таким образом, мы можем изучить ультра структурную характеристику синаптических мембран на нервно-мышечном стыке. Мы сделали щелчок. Мы провели фенотипический анализ дендритов ACC в штамме мутантов, и обнаружили, что инъекция Dscam1-Dock-Pak определяет место наросты дендрита в aCC.
