Наш протокол может быть использован для визуализации структурной сложности органоидов, что позволяет отображение идентичности, сульфата и распределения в этих 3D-структурах при одноклеточном разрешении. Наш быстрый трехдневный протокол полностью оптимизирован для органоидов различного происхождения и использует простой препарат образца, который включает в себя нетоксичный оптический клиринговый шаг и метод монтажа на основе кремния. Хотя наш протокол прост, некоторые из них являются критическими шагами, такими как организованная обработка или подготовка слайда, можно лучше объяснить с помощью визуальной демонстрации, чем с помощью текста.
Чтобы восстановить органоиды диаметром от 100 до 500 микрометров, выращенные в экстракте мембраны подвала в 24 пластинах, мыть каждый сварной шв, который будет собран с помощью PBS, не нарушая 3D матрицы, и поместить пластину на лед. Добавьте один миллилитр ледяного раствора восстановления к каждой скважине и поместите пластину на горизонтальный шейкер при четырех градусах по Цельсию в течение 30-60 минут. Опустите один миллилитр пипетки советы в 1%BSA в растворе PBS и пипетки вверх и вниз два раза, чтобы покрыть каждый совет с BSA.
Далее, добавить пять миллилитров 1%PBS BSA до одного 15 миллилитров трубки на состояние, и инвертировать трубку два-три раза, прежде чем отказаться от раствора, чтобы покрыть внутреннюю часть трубки. Чтобы собрать органоиды, используйте наконечник с покрытием, чтобы аккуратно повторно приостановить содержимое хорошо от пяти до 10 раз, и вытащить все органоиды из каждого состояния в одной покрытой 15 миллилитровой трубки. Промыть каждый хорошо с одним миллилитр ледяной 1%PBS BSA, чтобы убедиться, что все органоиды были собраны, и передать моет в соответствующие трубки.
Довнесите окончательный объем в каждой трубке до 10 миллилитров с холодным PBS, и осадок органоидов центрифугации, чтобы получить плотную палитру без видимого слоя 3D матрицы. Чтобы исправить органоиды, используйте покрытием один миллилитр пипетки отзыв тщательно повторно приостановить каждую гранулу в один миллилитр ледяной пара формальдегид, и исправить при четырех градусах по Цельсию в течение 45 минут. Аккуратно повторно приостановить органоиды на полпути через время фиксации.
Через 45 минут, добавить 10 миллилитров ледяной PBS плюс tween 20 к каждой трубке и осторожно перемешать инверсии, прежде чем поместить трубки на четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Чтобы блокировать органоиды, в конце инкубации, спина вниз образцов и повторно приостановить гранулы, по крайней мере 200 микролитров ледяной органоид стиральный буфер на хорошо, чтобы быть покрын. Затем перенесите органоиды в отдельные скважины из 24 скважин подвески пластины в течение 15 минут инкубации при четырех градусах по Цельсию.
Для иммунолабеля добавьте 200 микролитров органоидного стирального буфера в пустой эталонный колодец и позвольте органоидам осесть на дно пластины. Когда органоиды поселились, наклоните пластину под углом 45 градусов, чтобы удалить все, кроме последних 200 микролитров буфера стирки. Далее добавьте 200 микролитров органоидного стирального буфера, содержащего основные антитела, представляющие интерес, и поместите пластину на ночь при четырех градусах Цельсия с мягким раскачиванием и встряхивания на 40 оборотов в минуту.
На следующее утро, добавить один миллилитр органоидных стиральный буфер к каждому хорошо, и позволяют органоидов поселиться на дне пластины в течение трех минут. Когда органоиды поселились, удалить все, кроме последних 200 микролитров из каждого хорошо, и мыть органоиды с трех двухчасовых моет с одним миллилитр свежего органоидного стирального буфера, и мягкий качания и встряхивания за стирку. После третьей стирки, дайте органоидам поселиться в нижней части пластины в течение трех минут, прежде чем удалить все, кроме последних 200 микролитров органоидного стирального буфера из каждой хорошо.
Добавьте 200 микролитров органоидного стирального буфера, содержащего соответствующие вторичные антитела к каждому хорошо для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию с мягким качанием и тряской. На следующее утро, мыть органоиды с трех двухчасовых моет в один миллилитр свежего органоидного стирального буфера на стирку, как попродемонстрировано. После последней стирки перенесите органоиды в одну 1,5 миллилитровую трубку на колодец и соберите органоиды путем центрифугации.
Для оптической очистки органоидов, удалить как можно больше мыть буфера из каждой трубки, как это возможно, не нарушая органоидов, и использовать модифицированные 200 микролитров пипетки отзыв добавить по крайней мере 50 микролитров FUnGI к каждой гранулы. После 20-минутной инкубации при комнатной температуре органоиды могут храниться до одной недели при четырех градусах Цельсия или до шести месяцев при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для подготовки слайдов для органоидной визуализации с помощью конфокарной микроскопии заполните 10 миллилитров шприц с силиконовым герметиком и прикрепите к шприцу модифицированный 200-миллиметровый пипетку.
Используйте шприц, чтобы нарисовать прямоугольник один на два сантиметра в середине слайда, и использовать второй модифицированный 200 микролитровый наконечник пипетки, чтобы поместить очищенные органоиды в середине прямоугольника. Чтобы поместить крышку скольжения над органоидами, поместите левую сторону крышки скольжения вниз во-первых, прежде чем медленно опуская крышку скольжения слева направо, пока нет захваченного воздуха. Затем аккуратно нанесите давление на все края крышки скольжения, чтобы прочно прикрепить его к силиконовому герметикому.
Чтобы изображение органоидов, поместите слайд на сцену конфокального лазерного сканирующего микроскопа, и выберите несколько погружение 25 X цель для конфокальных изображений. Установите микроскоп в соответствующие настройки приобретения, выбрав низкую мощность лазера, чтобы уменьшить отбеливание фотографий. Используйте режим стека для определения верхних границ нижнего конца и установите оптимальный размер шага.
При визуализации больших органоидных структур, или несколько органоидов вместе, использовать режим плитки с 10% перекрытия и указать область интереса. Когда все параметры будут установлены, получите 3D-рендеринг изображения в программном обеспечении для визуализации и оптимизируйте яркость, контрастность и свойства 3D-рендеринга. Затем экспорт RGB снимки результатов, как TIFF файлов.
Сила 3D-изображения по сравнению с 2D-изображения иллюстрируется этими изображениями органоидов молочной железы мыши, которые были созданы, как показано на фото. Центральный слой этих репрезентативных органоидов состоит из колонно-образных клеток K8/K18 положительной светимости, а внешний слой содержит удлиненные положительные клетки базилика K5, резюмирует морфологию молочной железы in vivo. Эта поляризованная организация является сложной задачей для оценки из 2D оптической части того же органоида.
Другим примером сложной структуры, которую невозможно интерпретировать без 3D-информации, является сеть положительных canaliculi MRP2, которые облегчают сбор желчной жидкости органоидов печени человека. Кроме того, полученное качество и разрешение позволяют полуавтоматической сегментации и анализа изображений. Таким образом, общее количество клеток и наличие маркеров можно количественно оценить в конкретных клеточных подтипах в целых органоидах.
Сегментация ядер всего органоида, содержащего 140 клеток, можно определить три клетки, которые демонстрируют высокую положительность для маркера клеточного цикла Ki67. Оптический клиринговый агент, FUnGI, превосходит неясную и фруктозно-глицероловую очистку при флуоресцентном качестве сигнала глубоко внутри органоида. С FUnGI очищены органоиды демонстрируют общую повышенную интенсивность флуоресценции по сравнению с неясными органоидами.
Обратите внимание, что любой оставшийся BME в образце может привести к снижению проникновения антител и может привести к высокому фоновому сигналу. Кроме того, кистозные органоиды не должны быть оптически очищены, если они разрушаются. При небольших адаптациях к протоколу образцы можно использовать с помощью конфокального, мультифотонного и светового листа микроскопии.
