Это очень точный и экономически эффективный метод для понимания экспрессии генов на уровне одной клетки. Основным преимуществом этой техники является то, что мы можем поместить 96 образцов в одну партию. Такое большое количество образцов позволяет идентифицировать клеточные подфенотипы с анатомией.
Конвейер этого метода может быть применен к любой биологической проблеме, любой системе, любой ткани, для того, чтобы узнать об индивидуальной клеточной реакции отдельных нейронов или других типов клеток на болезнь или любое другое нарушение, любую функцию. А затем пойти дальше и узнать, есть ли эти ответы клеток анатомической архитектуры. Удалите мозг из коробки сбора тканей и поместите на криостат патрон.
Соберите 10 микрон секций, содержащих центральное ядро миндалины или других предпочтительных области мозга путем оттепели монтажа 10 микрон разделов на простых стеклянных слайдов. Сразу же поместите стеклянные горки на металлическую кастрюлю, опираясь на сухой лед. Положите слайды с секциями мозга в морозильную камеру минус 80 градусов по Цельсию как можно скорее.
Для выполнения серии обезвоживания этанола и ксилена, сначала окуните слайды в 75% этанола в течение 30 секунд. Сразу после этого окуните горки в 95%этанол в течение 30 секунд. Затем окуните слайды в 100%этанол в течение 30 секунд.
Наконец, опустите слайды прямо во второй контейнер 100% этанола в течение 30 секунд. После серии обезвоживания этанола, окунуть слайды в свежевылитый ксилен в течение одной минуты. Сразу же после этого окуните слайды во второй контейнер с ксиленом в течение четырех минут перед сушкой, как описано в текстовом протоколе.
Используйте флуоресценцию для определения типа окрашенных клеток и их ядра в области интереса. Выберите одну ячейку или несколько ячеек, если вы делаете образцы с объединением одной ячейки. Отметйте ячейки, представляющие интерес, с помощью программного обеспечения для захвата лазера или LCM.
Поместите крышку LCM поверх ломтика на область интереса и растопьте клей крышки LCM над областью выбранной одной ячейки, как описано в текстовом протоколе. Выберите отдельные ячейки, которые будут собраны для анализа с помощью программных средств LCM. Выбранные клетки должны быть в анатомические области центрального ядра миндалины на основе атласа мозга крыс и брегмы.
Клетки должны быть не менее трех микрон из соседних окрашенных ядер. Затем стреляйте инфракрасным лазером, чтобы собрать идентифицированные одиночные клетки. Поместите крышку в КК станции и просматривать его, чтобы убедиться, что только желаемые клетки были выбраны.
Если другие клетки были выбраны по ошибке, ультрафиолетовый лазер может быть использован для уничтожения нежелательных клеток, в то время как крышка остается на станции КК. Смойте раздел ткани, откуда была собрана клетка, чтобы задокументировать ее анатомические особенности. Запись расстояние ломтик от брегмы, если это уместно с помощью атласа мозга крысы в качестве эталона.
Удалите крышку LCM со станции КК и прикрепите устройство для извлечения образца. Затем пипетка 5,5 микролитров буфера лиза на образец. Fit извлечения устройства на 0,5 миллилитров микроцентрифуг трубки и поместить его на горячую пластину при 75 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
Спин вниз образца и лиза буфера в течение 30 секунд на низкой скорости и поместить собранный образец в минус 80 градусов по Цельсию морозильник. Для предварительного усиления одноклеточной мРНК для динамического чипа массива, сначала добавьте пять микролитров 5X VILO к каждой колодец новой пластины 96 на 96 ПЦР. Удалите образцы одноклеточных клеток LCM из минус 80 градусов по Цельсию и дайте им ненадолго оттаять.
После центрифугации на низкой скорости добавьте 5,5 микролитров облитых образцов одноклеточных клеток к пластине ПЦР, добавляя каждый образец к своей собственной хорошо. Поместите пластину ПЦР с образцами и VILO в термоциклер и нагревать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение полутора минут. Затем вращаем тарелку в течение одной минуты при 1 300 г и 4 градусах по Цельсию и помойкаем тарелку на лед.
Добавьте 10X cDNA синтез мастер смесь, T4 Gene 32 Белок, и буфер подвески ДНК для каждой хорошо. Поместите пластину ПЦР, которая является образцовой пластиной, в термоциклер и запустите ее в текстовом протоколе. После цикла добавьте девять микролитров раствора полимеразы Taq к каждой пластине ПЦР на 96 колодец.
Девять микролитров состоят из 7,5 микролитров мастер-микса Taq polymerase и 1,5 микролитров грунтовки. Теперь поместите пластину ПЦР в термоциклер и запустите программу предварительного усиления, подробно описанную в текстовом протоколе. Следуя протоколу предварительного усиления, добавьте шесть микролитров раствора экзонуклеазы к каждой колодец в 96-хорошо ПЦР пластины.
Раствор экзонуклеазы состоит из 0,6 микролитера 10X экзонуклеазы - одного буфера реакции, 1,2 микролитера экзонуклеазы-1 и 4,2 микролитров буфера подвески ДНК. Поместите пластину ПЦР в термоциклер и запустите программу, указанную в текстовом протоколе. Наконец, добавьте 54 микролитров буфера TE к каждому колодец образца пластины один.
Спин ПЦР пластины на 1, 300 раз г в течение пяти минут. Хранить при четырех градусах по Цельсию, если сразу же продолжить следующий шаг. В новую пластину ПЦР из 96 колодец, которая является образцом пластины два, добавьте пять микролитров ДНК-связывающего красителя и мастер-микст-раствор.
Добавьте три микролитера предварительно усиленных образцов из образца пластины один в соответствующие скважины в образце пластины два. Спин ПЦР пластины на 1, 300 раз г, а затем положить пластину на лед. В новую 96-хорошо ПЦР пластины, которая является анализ пластины два, добавить пять микролитров анализа погрузочного решения для каждой хорошо.
Решение для загрузки Assay состоит из 3,75 микролитров 2X GE, анализующихся на загрузку реагента, и 1,25 микролитров буфера подвески ДНК на колодец. Затем добавьте 2,5 микролитера 10 микромолярной грунтовки qPCR из анализа пластины один к соответствующей хорошо в анализе пластины два. Спин ПЦР пластины на 1, 300 раз г в течение пяти минут.
Чтобы загрузить и запустить динамический чип массива, сначала премьер чип с жидкостью линии управления. Затем поместите чип в контроллер IFC HX и запустите сценарий prime 136X. Добавьте шесть микролитров из образца пластины два в соответствующие выборочные скважины в 96 на 96 динамических чипов массива.
Теперь добавьте шесть микролитров из анализа пластины два в соответствующие скважины анализа в 96 на 96 динамический чип массива. Используйте иглы, чтобы поп любые пузырьки воздуха в колодцах 96 на 96 динамический чип массива. Затем поместите чип в контроллер IFC HX и запустите сценарий нагрузки 136X.
Затем удалите чип из контроллера IFC HX. Поместите чип динамического массива 96 на 96 в микрофлюидную платформу RT-qPCR и запустите протокол GE fast 96 на 96 ПЦР. Выбор одиночных клеток был проверен как визуально, так и молекулярно. Визуально клеточная морфология рассматривалась перед сбором клеток.
Здесь показаны репрезентативные изображения слайда с гемисектным крысиным мозгом, содержащим центральное ядро миндалины. Последующие изображения показывают выбор одиночных клеток и их удаление из ткани для транскриптомного анализа. Молекулярно, маркеры типа клетки продемонстрировали увеличенное выражение в их соответственно типе клетки.
В частности, повышенная экспрессия NeuN наблюдалась в нейронах, Maf в микроглии и Gfap в астроцитах. Тепловая карта показывает экспрессию всех образцов в 40 анализах генов. Строки являются напряженными образцами объединения, цифры обозначают образцы кластеров и столбцы генов.
Многовариантные методы анализа показывают, что астроциты в группе вывода были наиболее пострадавших типов клеток. Основываясь на этих данных в контексте других исследований, астроциты, вероятно, играют ключевую роль в воспалении в центральном ядре миндалины во время опиоидного вывода. Самое главное, чтобы помнить об этом методе является использование надлежащего трубопроводов, чтобы ограничить количество пузырьков воздуха.
Транскрипционные результаты этих экспериментов могут быть подтверждены с помощью методов измерения белка, таких как иммунофлуоресценция или западная помарка на той же ткани.
