Этот протокол описывает потенциально новую терапевтическую стратегию, которая может быть легко изменена для применения человеком. Этот метод непосредственно усиливает индукцию кишечника самонаведения регуляторных Т-клеток в периферических лимфоидных тканях и может быть стабилико реализован даже в весьма провоспалительных средах. Эти методы также могут быть использованы для исследования роли активного витамина D и витамина А в периферической иммунной системе.
Эта визуальная демонстрация будет предоставлять шаг за шагом инструкции для генерации высококачественных инженерных дендритных клеток, которые имеют решающее значение для успеха этой техники. Начните с посева один раз от 10 до семи 293T клеток в 20 миллилитров CM-10-D клеточной культуры среды в 150 на 25 миллиметров пластин культуры в течение 24 часов инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующий день добавьте 1,62 миллилитров свежеприготовленного двухкратного концентрированного раствора HBS, 9,5 микрограмма плазмидной оболочки, 17,5 микрограмма упаковочной плазмиды и 27 микрограммов плазминной плазмиды LENTI-CYP-ALDH до 50 миллилитров конической трубки.
Довнесите конечный объем содержимого трубки до 3,0375 миллилитров с водой с последующим добавлением 202,5 микролитров двух мларных хлорид кальция dropwise. Оставьте смесь осадков ДНК при комнатной температуре в течение 20 минут с редким смешиванием, прежде чем добавить 3,24 миллилитров раствора dropwise на 293T культуры, а осторожно закрученного блюдо. Поместите пластины в инкубатор в течение 24 часов, прежде чем аккуратно мыть каждую тарелку с PBS и кормления клеток с CM-4-D культуры среды.
После еще 24 часов культуры, урожай supernatants в стерильные бутылки для хранения при четырех до восьми градусов по Цельсию и кормить клетки со свежими CM-4-D среды в течение еще 24 часов. На четвертый день, урожай supernatants снова и процедить supernatants от обоих дней три и четыре до 0,45 микрометрового фильтра. Затем в течение 24 часов концентрируют псевдотипированный вирус VSV-G путем центрифугации.
На следующий день декант супернатантов. Разрешить трубки для слива на бумажное полотенце в стерильной био-безопасности кабинета в течение нескольких минут, а затем повторно гранулы в 33,3 микролитров стерильных PBS, содержащих 5%глицерол на культуру блюдо. Для костного мозга, полученных дендритных клеток поколения, место голени и бедренной кости, собранные из BALB / C мышей, в 100 на 20 миллиметров культуры блюдо, содержащее свежие среды культуры.
Используйте рассечение ножниц и типсов, чтобы удалить любые ткани из костей. Когда все кости были очищены, используйте ножницы, чтобы сократить оба конца каждой кости, чтобы разоблачить полости костного мозга. Используйте 10 миллилитров шприц оснащен 30 калибровочных иглы, чтобы промыть каждую кость с 10 миллилитров свежей среды культуры, собирая костного мозга в 15 миллилитров трубки.
Когда весь костный мозг был собран, осадок костного мозга путем центрифугации и повторно гранулы в двух миллилитров буфера лиза красных кровяных телец. После четырех-пяти минут при комнатной температуре с редким встряхиванием, остановить реакцию с 10 миллилитров клеточной культуры среды и собирать клетки центрифугации. Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров среды культуры CM-10-R для подсчета и корректировки клеток на один раз от 10 до шести клеток на миллилитр средней концентрации культуры CM-10-R.
Затем добавьте к клеткам 100 единиц на миллилитр рекомбинантного мурина GM-CSF и 10 единиц на миллилитр ИЛ-4. Плита четыре миллилитров клеток в отдельных скважин из шести пластины культуры скважины для их инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 48 часов. В конце инкубации осторожно аспирируют неприемленные клетки.
Добавьте свежую среду, дополненную GM-CSF и IL-4, к культурам, прежде чем возвращать клетки в инкубатор клеточной культуры для добавления 48 часов. В конце второй инкубации, урожай непритята костного мозга производных дендритных клеток в 50 миллилитров конической трубки для их центрифугации. Для генерации клеток BMDC-CYP-ALDH, перерасход культур в один раз десять-шестой дендритных клеток на 500 микролитров CM-10-R среды на концентрацию хорошо, и пластины 500 микролитров клеток в каждый колодец из новых шести хорошо культуры пластины.
Добавьте 50 микролитров вируса LENTI-CYP-ALDH и 8 микрограмм на миллилитр протамина в каждую колодец, затем поместите пластину в инкубатор на 24 часа. На следующий день замените супернатанты свежей культурной средой и верните пластины в инкубатор клеточной культуры еще на 24 часа. В конце второй инкубации клетки могут быть активированы со 100 нанограммами на миллилитр липополисахарид на колодец в течение 24 часов до сбора урожая для функционального анализа.
По сравнению с родительскими клетками костного мозга, полученными дендритными клетками, клетки BMDC-CYP-ALDH демонстрируют повышенную экспрессию 1-альфа-гидроксилазы. Концентрации активной формы витамина D в культурных супернатантах клеток BMDC-CYP и BMDC-CYP-ALDH примерно в 20 раз выше, чем в родительских культурах костного мозга, полученных дендритными клетками и клеточными культурами BMDC-ALDH. Средняя флуоресцентная интенсивности клеток BMDC-CYP-ALDH, обработанных субстратом, примерно в шесть раз выше, чем у родительских клеток костного мозга, полученных дендритными клетками, обработанными субстратом.
Это говорит о том, что клетки BMDC-CYP-ALDH выражают значительно усиленную дегидегидрогеназу сетчатки-2. Клетки DC2.4, обработанные 25-гидрокси витамином D и сетчаткой, не вызывают существенных изменений в обилии foxp3 положительных положительных Т-клеток CCR9. В отличие от этого, DC2.4 CYP-ALDH клетки, обработанные 25-гидрокси витамина D и сетчатки вызывают значительно большее количество кишечника самонаведения нормативных Т-клеток в концентрации зависимым образом.
Кроме того, по сравнению с интраперитонально вводили контрольные клетки, DC CYP-ALDH клетки также вызывают значительное увеличение числа Foxp3 положительные CCR9 положительные Т-клетки CD4 после внутриперитонеальной инъекции в BALB / C реципиент животных. Успех процедуры зависит от подготовки здоровых Т-клеток и правильно подготовленной смеси ДНК.
