Трансгенные животные имеют основополагающее значение для современных биомедицинских исследований, поскольку они позволяют исследования функции генов в живых организмах. Различные методы генетических модификаций были применены в исследованиях на животных. Здесь мы представляем широко доступный и эффективный метод, который использует лентивирусные векторы в качестве инструмента для включения трансгена в геном эмбриона крысы.
После человека хорионического гонадотропина администрации, мат пятинедельный Wistar самки крыс один к одному с сексуально плодородной от трех до 10-месячного Wistar мужчин. На 8-10 утра.m. на следующее утро, проверить женщин на наличие вагинальной пробки и урожай яйцеклетки из самок с спаривания штепсельной вилки не позднее чем на 10 .m.
в коллекционое блюдо, содержащее предварительно разогретую среду M2. Когда все яйцеклетки были собраны, перенесите ткани в 35-миллиметровое блюдо, содержащее предварительно разогретую среду M2, дополненную 0,5 миллиграммами на миллилитр гиалуронидазы из бычьих яичей, и поместите блюдо под стерео микроскоп. Используйте тонкие типсы, чтобы открыть стенки яйцеклетки и нажмите ампулы, пока эмбрионы не будут освобождены.
Чтобы облегчить высвобождение эмбрионов из кучевых клеток, используйте стеклянную трубчатую трубу, подключенную к трубчатой трубке, работаемой во рту, чтобы аккуратно пипетки эмбрионов вверх и вниз. Когда все эмбрионы были освобождены, мыть клетки несколько раз в свежем M2 среды для удаления гиалуронидазы и клеточного мусора. Перенесите эмбрионы в отдельные 50 микролитровых капель предварительно equilibrated M16 среды, покрытой минеральным маслом в 60-миллиметровой тарелке.
Затем поместите блюдо в увлажненной 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%carbon dioxide атмосферу до их инъекции. Для лентивирусного векторного микроинъекции под зоной pellucida одноклеточной стадии эмбрионов, используйте пипетку шкив для подготовки микроинъекции борозиликатных стеклянных капилляров с нитью. После каждого изменения нити или использования нового стеклянного капилляра, проведите тест Ramp, чтобы установить оптимальные параметры.
Далее используйте наконечник микрозагрузочницы для загрузки примерно двух микролитров свежеоттаяного лентивирусного раствора на микроинъекцию пипетки под капотом ламинарного потока биобезопасности. Добавьте 100 микролитровую каплю среды M2 к центру крышки из 60-миллиметровой чашки Петри. Обложка среды с минеральным маслом и смонтировать проведение пипетки и вирус загружен микроинъекции капилляров на микроманипулятор.
Поместите микроинъекцию под перевернутый микроскоп и перенесите 15-20 одноклеточных эмбрионов в каплю M2 в микроинъекции. Захват одного эмбриона с проведением пипетки и использовать 400 раз увеличение и стеклянный капилляр для введения лентивирусного раствора под zona pellucida в perivitelline пространстве проведения капилляров под zona pellucida на мгновение после того, как вирус был доставлен. Когда все эмбрионы были введены, используйте тонкую пипетки, чтобы вернуть инъекционные клетки в культуру блюдо и вернуть блюдо в инкубатор клеточной культуры до их имплантации.
Чтобы подготовить приемных матерей для переноса эмбриона, мат сексуально зрелых Sprague-Dawley женщин с вазэктомизированных мужчин и проверить женщин на следующее утро для вагинальной пробки. Подтвердив отсутствие реакции на педаль рефлекса у анестезироваемых самок с жизнеспособной вилкой, нанесите мазь на глаза животного и побрите мех со спины каждого животного. Поместите первую крысу в положение склонного на чистую поверхность на грелку под хирургическим микроскопом.
Обложка крысы с стерильной драпировки с небольшим отверстием сократить над нижней части спины и сделать примерно два сантиметра кожи разрез параллельно поясничного позвонка колонки. Используйте острые ножницы, чтобы сделать разрез в брюшной стенке и использовать типсы, чтобы схватить яичников жира площадку. Вытяните яичник и яйцеклетку из брюшной полости на кусок 0,9% хлорида натрия пропитанной марлей.
Загрузите M2 средний, три пузырька воздуха, и эмбрионы в капилляр передачи. Используйте микросциссоры, чтобы сделать небольшой разрез в яйцеклетку между infundibulum и ампулы и вставить кончик передачи пипетки в разрез. Аккуратно изгнать эмбрионы и пузырьки воздуха в яйцеклетку, а затем использовать тупые типсы, чтобы поместить репродуктивный тракт обратно в брюшную полость.
Шов брюшной стенки с полигликолиновой кислотой абсорбируемых швов и закрыть разрез кожи с раны клипс и поместить животное в чистую клетку на греющей пластине с мониторингом до полного лежачих. Для вазэктомии потенциальных товарищей, после подготовки мужской крысы для хирургии, как попродемонстрировано, использовать 70% этанола и хирургический скраб для дезинфекции кожи над яичками. Аккуратно нажмите живот, чтобы разоблачить яички в мошонке мешок и покрыть крысу стерильной драпировки с небольшим отверстием над хирургическим сайтом и использовать мошонки ножницы, чтобы сделать 0,5 сантиметра разрез в середине мешка.
Тщательно нажмите яичка влево и найти vas deferens между яичком и средней линии, как белый проток с одним кровеносным сосудом. Используйте типсы часовщика, чтобы аккуратно вытащить ваз deferens из мошонки мешок и проведение судна с типсами, использовать тонкие ножницы, чтобы удалить один сантиметр фрагмента из протока. Повторите процедуру второго яичка, как только что продемонстрировано, и закройте кожу полигликолиновой кислотой абсорбируемых швов.
Затем поместите крысу в чистую клетку на греющие пластины с мониторингом до полного лежачих. В этом репрезентативном эксперименте, в котором одиночные эмбрионы вводились несколько раз, восемь крыс родились из эмбрионов, которые были введены два раза, три из которых были подтверждены для перевозки трансгена. Один из основателей не передачи трансгена потомству и три приемные самки были использованы для каждой экспериментальной установки.
Выбранный подход позволил генерации стабильных трансгенных линий крыс, которые выразили TDP-43-eGFP синтез белка под контролем нейрональной синапзы в одном промоутер по всей центральной нервной системы. Трансгенез на основе лентивируса привел к одной копии вставки трансгена, о чем свидетельствует количественный ПЦР. Когда этот метод был использован для других лентивирусных векторов, наблюдалась примерно 90%выживаемость.
Процент эмбрионов, переживших проядерные инъекции, был значительно ниже. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что беременные самки крыс могут быть использованы в качестве приемных матерей с сопоставимой эффективностью. Примечательно, что численные данные, которые были проанализированы для отдельных раундов микроинъекции, показали, что эффективность имплантации напрямую зависит от количества инъекций в один эмбрион и косвенно от вирусной нагрузки.
Использование лентивирусных векторов гарантирует геномную интеграцию и передачу трансгена и способствует высокой выживаемости микроманипированных эмбрионов даже при проведении нескольких поддермальных инъекций. Эта процедура может быть эффективно применена к другим видам и может рассматриваться как альтернатива традиционному трансгенезу.
