Текущие модели заболеваний для эндотелиальной потери роговицы клетки сосредоточиться на разрушении эндотелия и, скорее всего, представляют собой заключительные стадии заболевания, когда трансплантация роговицы неизбежна. Новые методы лечения с использованием стволовых клеток или генной терапии, однако, в настоящее время доступны, которые могли бы быть более полезными для ранних стадиях заболевания, модели для которых отсутствуют. Неинвазивная внутриглазная хирургия с помощью фотоподкупа с помощью лазера Nd:YAG стала обычной процедурой для офтальмологов.
После получения свежеухвеченных свиных глаз из местной скотобойни, поместите образцы в четыре градуса по Цельсию полной среды. Используйте ножницы, чтобы удалить внеклеточные ткани и замочить глаза в 5%povidone йод офтальмологический раствор в течение пяти минут. Затем поместите дезинфицированные образцы в стерильный PBS при комнатной температуре.
Используя спектральный домен оптической когерентной томографии устройства, экран глаза для основных патологий переднего сегмента, таких как рубцы роговицы, отек, и другие непрозрачности. После скрининга, положение глаз перед скольжения лампы блок оснащен Nd:YAG лазер с длиной волны 1, 064 нанометров и фокусное пятно диаметром 10 микрометров в воздухе. Выберите 12X увеличение и отвлечь освещение, чтобы визуализировать отдельные слои роговицы.
После установки импульсной энергии и фокусировки указать на соответствующие параметры для селективной абляции эндотелиальных клеток роговицы, применить несколько лазерных выстрелов в ткани. Затем под рассекающий микроскоп, поместите четкий парацентез роговицы близко к лимбусу и ввилите вязкость для стабилизации передней камеры. Затем используйте восьмимиллиметровый трефин, чтобы вырезать лазер, обработанный центральной роговицей, и поместите изолированную роговицу в один колодец эндотелиальной стороны пластины 12-хорошо.
Когда все роговицы были собраны, добавить три миллиметра полной среды к каждому образцу хорошо и инкубировать образцы на срок до трех дней при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации замените среду в каждой хорошо с метанол-бесплатно 4%paraformaldehyde в буфере Соренсена для 20-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации поместите фиксированные образцы в 20% сахарозы в PBS в течение примерно одного часа, пока роговицы раковина.
Передача образцов в 30% сахарозы в PBS ночь перед встраиванием тканей в оптимальной температуре резки для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используйте криостат, установленный до минус 27 градусов по Цельсию, чтобы получить 10 микрометровых секций замороженных тканей, собирающих каждый раздел на слайде микроскопа в течение одной минуты после его приобретения. Затем храните горки при температуре минус 80 градусов по Цельсию до окрашивания.
Для окрашивания гематоксилина и эозинов воздух высушит замороженные секции в течение нескольких минут, чтобы удалить влагу перед окрашивание фильтрованным гематоксилином 0,1%Mayer в течение 10 минут в 50-миллилитровой трубке. В конце инкубации, промыть горки в двойной дистиллированной воды в течение пяти минут в cuvette. Затем окуните горки в 0,5%эозин 10 раз, а затем окуните полоскания в двойной дистиллированной воде, пока эозин останавливается полос.
Опустите промытые горки 10 раз в 50% этанола и 10 раз в 70% этанола. После последнего падения 70% этанола, эквилибрировать разделы в 95%этанола в течение 30 секунд, а затем 60 секунд в 100% этанола до нескольких провалов в ксилена. Затем смонтировать образцы с крышкой, прежде чем получить изображения на световом микроскопе.
Два фотона и световой микроскопии изображения должны быть независимо оценены как никакого ущерба, слишком большой ущерб, или правильное количество ущерба. На основе этих оценок можно рассчитать тепловую карту, чтобы выбрать правильное созвездие лазерных параметров для селективной абляции эндотелиальных клеток роговицы с минимальным ущербом окружающим тканям. Предыдущий анализ показал, что координационный центр лазера должен быть не менее 0,15 миллиметра позади эндотелия роговицы для самого низкого импульсного импульса энергии испытания.
Для импульсных энергий выше 2,9 миллиджоулей, самое длинное фокусное расстояние, испытанное, все еще слишком близко к эндотелию. Различные цитопротекторные агенты могут быть протестированы в то время как подакцизные образцы находятся в культуре. Если они оказались успешными, они могут быть добавлены в раствор орошения для лечения.
