Изучение того, как микробы регулируют химический состав отдельных билейеров, позволит нам узнать о механизмах убийства антибиотиками, устойчивости к противомикробным препаратам и патогенеза болезней. Этот метод разделы клеточной оболочки грамотрицательных бактерий на две определенные фракции без использования моющего средства. Таким образом, липиды, белки и сахара могут быть оценены в среде, которая является полу-родной.
Некоторые из этих шагов зависят от времени и требуют сосредоточения внимания и координации. Первоначально используйте один или два образца. Когда уровень комфорта повышается, можно добавить больше образцов.
Не более шести образцов должны быть обработаны одновременно. Это многодневная процедура и визуальные контрольно-пропускные пункты полезны для оценки эффективности и ошибок. До выполнения этого иногда заключительные шаги.
Перенесите бактерии из замороженных запасов глицерола на свежие агарные пластины. Как только колонии развиваются, хранить пластины при четырех градусах по Цельсию. Используйте одну колонию, чтобы привить пятими миллилитровую трубку, наполненную бульонными средствами массовой информации и культурой бактерий по желанию в одночасье.
Назад разбавить ночь бактериальной культуры в один литр предпочтительного бульона средств массовой информации и инкубировать колбы. Когда желаемая оптическая плотность будет достигнута, удалите колбы из инкубатора и поместите их на лед. Измерьте оптическую плотность культуры на уровне 600 нанометров и рассчитайте объем культуры, эквивалентный от шести до восьми раз от 10 до одиннадцатой бактериальной колонии, образующей единицы.
Добавьте этот объем культуры в трубку центрифуги и убедитесь, что остальные культуры остаются на льду до тех пор, пока они не будут использоваться. Пеллет бактерий центрифугации в течение 10 минут ina фиксированный угол, высокая скорость центрифуги на 7000 до 10000 раз G и четыре градуса по Цельсию. Тщательно декант супернатант и отбросить его.
Resuspend каждой ячейки гранулы в 12,5 миллилитров буфера A.Add магнитного перемешивания бар для подвески клетки. Добавьте 180 микролитров по 10 миллиграммов на миллилитр лизозим для повторного незаменимия каждой клетки. После сбора лизозима ЭДТА обработанных бактерий центрифугации, быстро добавить ингибитор протеазы, хлорид магния и нуклеазы к бактериям и быстро повторного перерасхода клеток в буфере B.Stir в течение двух минут, сохраняя суспензии на льду.
Затем добавьте 12,5 миллилитров раствора EDTA 1,5 миллимолярной EDTA к каждой клетке и продолжайте перемешивание на льду в течение еще семи минут. Декант суспензий в 15 миллилитров конических труб. Центрифуга суспензий при 9000-11 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Выбросьте супернатанты в контейнер для биологических отходов и сохраните гранулы на льду. Добавьте 25 миллилитров буфера B к каждой клеточной грануле. Затем добавьте 55 микролитров одного хлорида молярного магния, один микролитер рнкзы/ДНК/нуклеазного реагента и один микролитер ингибитора протеазы.
Повторное производство гранул в смеси. Энергично пипетки и вихри до тех пор, пока растворы не появятся однородными. Храните подвески на льду.
Налейте образец в цилиндр образца гомогенизатора и доввейте ячейку до 20 000 PSI. Чтобы избежать аэрозолизации патогенных микроорганизмов, состояние под давлением аппарата в буфере B и регулировать уровень давления, прежде чем добавлять бактериальной суспензии. Привлекайте ячейку давления и уполяйте 10 миллилитров буфера B в качестве меры предосторожности.
Соберите лисат клетки в 50 миллилитровых конических трубках на льду, сохраняя при этом образцы на льду. Для достижения полного лиза повторите этот процесс три-пять раз. Чтобы гранулировать оставшийся, нетронутый, клеточный материал, центрифугу лисированные бактериальные образцы в 6, 169 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут.
Распределите супернатанты, которые в настоящее время содержат гомогенизированные мембраны, в поликарбонатные бутылки для ультрацентрифугации. Ультрацентрифуг клетки лисирует при 184, 500 раз G и четыре градуса по Цельсию, по крайней мере один час. Откажитесь от супернатантов и сохраните мембранные гранулы на льду.
Используя стекло, Dounce гомогенизатор, повторно гранулы мембраны в один миллилитр низкой плотности изопицинового градиентного раствора сахарозы. Затем используйте стекло, Пастер пипетки для передачи образца гомогената в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки и место трубки на льду. Чтобы подготовить градиент сахарозы, удерживайте полипропилен или ультра-чистую трубку Open-Top в слегка наклоненом положении.
Медленно добавьте два миллилитров раствора сахарозы более высокой плотности. Затем добавьте четыре миллилитров раствора сахарозы более низкой плотности. При подготовке градиента плотности, добавить раствор сахарозы медленно, чтобы избежать смешивания слоев.
Слои сахарозы должны быть слегка видимыми и выглядеть в целом определенными. Далее добавьте общую мембранную фракцию, которая ранее была повторно использована в одном миллилитре низкой плотности, растворе изопихной сахарозы. Наконец, заполните оставшуюся часть трубки, добавив около шести миллилитров низкой плотности, изопицинового градиентного раствора сахарозы.
Ultracentrifuge образцов с помощью размахивая ротор ведро на 288000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 16 до 23 часов. Отрежьте конец от наконечника пипетки P1000 около пяти миллилитров от точки. После того, как центрифуга завершена, используйте пипетку, чтобы удалить верхний, коричневый слой из трубки.
Перенесите этот слой, содержащий внутреннюю мембранную фракцию, в поликарбонатную бутылку для ультрацентрифугации. Оставьте около двух миллилитров раствора сахарозы над интерфейсом между 53% сахарозой и 73%сахарозой, чтобы нижняя, белая, внешняя мембранная фракция не пересекала загрязнять внутреннюю мембранную фракцию. Опять же с помощью P1000 пипетки кончик с конца удалены, удалить внешний слой мембраны и передать его в поликарбонат бутылку.
Заполните оставшуюся пустоту поликарбонатной бутылки с изолированным буфером хранения мембраны и смешайте путем инверсии или pippetting. Сохранить образцы на льду. Для сбора мембран, ультрацентрифуг поликарбонат бутылки на 184, 500 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа.
Наконец, отбросьте супернатанты и добавьте от 500 до 1000 микролитров буфера хранения. Resuspend мембраны по гомогенизации Dounce. Соберите образцы в двух миллилитровых микроцентрифугных трубках.
Всего мембранных гранул были Царапины, Dounce гомогенизации и ультрацентрифугированных над градиентами плотности сахарозы, чтобы отделить внутренние и внешние мембраны. Градиент плотности сахарозы 20%53%73% был достаточен для разделения некоторых бактериальных штаммов. Но не для раздела A.baumannii, который был успешно разделен с использованием 20%45%73%градиента.
Для оценки эффективности разделения были протестированы образцы мембраны для дегидрогеназы NADH, фермента, расположенного в бактериальной внутренней мембране. Снижение оптической плотности на 340 нанометров указывает на наличие фермента. Оптическая плотность была измерена для 50 образцов микрограммов внутренних и внешних мембранных фракций дикого типа S.typhimurium, E.coli K12 DH5a и galE мутанта S.typhimurium.
Более высокая концентрация белка была добавлена при анализе чистоты мембранных фракций A.baumannii, потому что первоначальный анализ с использованием 50 микрограммов показал, что относительные уровни дегидрогеназы NADH были ниже для A.baumannii, чем для других бактериальных штаммов. Для оценки перекрестного загрязнения фракций внутренней мембраны с внешними мембранами были извлечены и визуализированы LPS и LOS. Экстракты были загружены на полиакриламинидный гель и окрашены Про-З Изумруд 300.
Acinetobacter baumannii является главным приоритетом, мульти лекарственно устойчивый, человеческий патоген. Этот протокол должен помочь исследователям в понимании роли липулигосахаридов, фосфолипидов и липопротеинов в механизмах резистентности и вирулентности этого уникального и важного патогена. Этот метод идеально подходит для вниз по течению анализа фосфолипидов, гликолипидов углеводов, белков и малых молекул, которые обычно существуют в двойных мембранах грамотрицательных бактерий.
