Органоиды головного мозга человека являются важным инструментом для изучения заболеваний в системе, которая легко манипулировать и включает в себя человека настройки и соответствующего взаимодействия нескольких типов клеток. Этот метод может быть применен для изучения многочисленных заболеваний головного мозга, в том числе нейроразвития расстройств, токсичных оскорблений, а также роста и лечения рака в головном мозге. Основным преимуществом этого протокола является способность генерировать высоко воспроизводимые органоиды мозга с широким спектром типов нейронных клеток.
Это делается с использованием очень упрощенного рабочего процесса, который может быть выполнен большинством лабораторий. И они производятся в временной соответствующей манере без влияния специализированных факторов роста или неопределенных матриц, что делает его очень простой и экономически эффективной системой. Для начала объединить 100 микролитров матрицы с 5,9 миллилитров ледяной Dulbecco модифицированных Eagle Medium или F12 средств массовой информации в 15 миллилитров конической трубки.
Пальто каждый хорошо в шесть хорошо пластины с одним миллилитр мембранной матрицы. Оберните пластину в парафиновой пленке и храните на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день, аспирировать излишки мультимедиа из каждой скважины, промыть скважины с F12, и добавить H9 hESCS в общем объеме двух миллилитров mTeSR1 средств массовой информации на скважину.
Культура клеток от недели к неделе. Поставка ежедневно с двумя миллилитров mTeSR1 средств массовой информации и место пластины в 37 градусов по Цельсию низкого кислорода инкубатор с 5%кислорода и 5%углекислого газа. Используйте стеклянные инструменты, чтобы отлецировать дифференциации клеток от культуры между проходами.
Обновление средств массовой информации ежедневно. Клетки должны быть протекали за четыре-шесть дней до использования клеток H9 для производства органоидов. Чтобы пройти клетки, начните с полоскания их с DMEM F12 средств массовой информации и аспирации избыточной жидкости.
После полоскания добавьте раствор протеазы и инкубировать клетки в течение 40 минут, чтобы колонии плавали внутри хорошо. Затем, мыть клетки три раза с помощью DMEM F12 и при необходимости титрат, чтобы сделать куски меньше. Затем распределить клетки в приблизительном соотношении один к восьми в течение четырех шести-хорошо пластин и поместить пластины в инкубатор и кормить ежедневно.
Через четыре-шесть дней клетки достигают примерно 80% стечения. Переведайте их в обычный инкубатор. Разбавить раствор протеазного бульона до рабочей концентрации, добавив один миллилитр раствора бульона в пять миллилитров DMEM или F12 среды на каждую шестиясную пластину hESCS.
Аспирировать и удалять средства массовой информации культуры клеток, а затем покрыть hESCS с протеазы решения. Поместите пластины в инкубатор в течение 10 до 15 минут или до тех пор, пока края колоний округлиться и начинают отделяться от матрицы, но прежде чем они округлить полностью. Наклоните пластину, аспирировать раствор протеазы и аккуратно промыть клетки двумя миллилитров DMEM или F12 для каждого хорошо три раза.
Убедитесь, что колонии остаются прикрепленными к матрице. Поэтому очень важно, чтобы части клеток ES были в соответствующем размере, поэтому убедитесь, что они находятся в dispase для соответствующего количества времени. Если они там слишком мало времени, это может быть очень трудно смыть их и разорвать их на части.
И если они там слишком долго, они могут на самом деле просто отойти во время мытья шагов. Добавить обратно около одного до 1,5 миллилитров свежих средств массовой информации mTeSR к каждому хорошо и смыть клетки с пластины в 50 миллилитров конической трубки с использованием нежной пипетки. Аспирировать и распределять hESCS в пластине, пока они не достигнут примерно 1/30th от их первоначального размера.
Сейчас скопления колоний напоминают кусочки размером от 250 до 350 микрометров. Перенесите клетки в одну сверхнизкую вяленую колбу T75, содержащую 30 миллилитров мультимедиа mTeSR без bFGF. На следующий день наклоните колбу так, чтобы живые клетки объединились в углу.
Если есть большое количество клеток, которые прилипли к нижней части колбы, используйте 10 миллилитров пипетки для передачи клеток в новую колбу. Ожидать, чтобы иметь высокую популяцию мертвых клеток в течение первых нескольких дней. После того, как клетки оседают, аспирировать от средств массовой информации и мертвых клеток оставляя около 10 миллилитров средств массовой информации, содержащих живые клетки и добавить 20 миллилитров низких средств массовой информации bFGF дополнены 30 нанограмм на миллилитр bFGF.
Через два дня проверьте клетки. Большинство клеток должны выглядеть здоровыми и яркими. Однако, если более трети клеток кажутся темными, наклоните колбу и замените 20 миллилитров мультимедиа на 20 миллилитров низких средств массовой информации bFGF, дополненных 20 нанограммами на миллилитр bFGF.
На третий день удалите половину мультимедиа и замените 15 миллилитров средств массовой информации hESC, дополненных 10 нанограммами на миллилитр bFGF. На пятый день замените половину мультимедиа 15 миллилитров нейронных индукционных средств массовой информации. После этого, через день, заменить половину среды с нервной индукции средств массовой информации.
После трех недель в культуре, добавить 100X пенициллин-стрептомицин в средствах массовой информации в окончательной концентрации 1X при желании. Освежите половину средств массовой информации через день. В этом протоколе сформированные органоиды мозга выглядели яркими и похожими по размеру без темных умирающих клеток в центрах этих скоплений.
Клетки были постепенно отуты от bFGF. На пятый день, они были помещены в нейронных средств индукции, и они остались в этом средств массовой информации на протяжении всего периода культуры. Несмотря на то, что органоиды со временем стало больше и тем темнее, расширились нейронные структуры, похожие на розетки, что указывает на начало нейронной дифференциации и содержит особенности эмбриональной нервной трубки.
Чтобы более углубленно взглянуть на экспрессию генов в клетках, был проведен qPCR-анализ. Глутамат транспортер VLGUT1 был выражен в две с половиной недели, увеличилось на пять недель, и оставался последовательным в течение пяти месяцев культуры. Маркер forebrain Foxg1 был выражен на низких уровнях до пяти недель в культуре.
Глубокий слой маркера Tbr1 достиг пика около пяти недель и впоследствии уменьшился. В то время как выражение верхнего слоя маркера Satb2, брюшной маркер Eng1, задний маркер спинного мозга Hoxb4, а также олигодендроцит маркер Olig2 все увеличилось с течением времени. В отличие от этого, маркер стволовых клеток Sox2 со временем уменьшился.
Глиальный маркер GFAP достиг пика в пять недель и оставался относительно постоянным впоследствии. Не забудьте принять максимальную осторожность при обработке ES клеток на ранней стадии органоидов, чтобы избежать загрязнения, как они выросли без антибиотиков, а также не забудьте кормить в соответствии с графиком. После этой процедуры, вы можете оценить органоиды с помощью таких методов, как количественные RT-PCR для экспрессии генов и иммунофторесценции для экспрессии белка и локализации.
Используя этот метод, мы смогли изучить способность небольшой молекулы, чтобы облегчить аспекты неонатальной гипоксической травмы человека, как моделируется в гипоксии камеры. Важно, что эти органоиды человеческого мозга вели себя так же, как эксперименты с мышью in vivo.
