Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет проводить сравнение микроваскулярности между различными регионами центральной нервной системы, а также между различными лицами. Этот метод изоляции микровесселя может быть завершен в течение одного дня, и это устраняет необходимость ультрацентрифугации и энзиматической диссоциации. Удаление окося и хороидного сплетения может быть трудно.
Будьте уверены, чтобы работать медленно и осторожно, чтобы обеспечить полное удаление каждой ткани. Для вскрытия ткани ЦНС из небольшого образца лиссенцефалических позвоночных поместите собранный мозг в 15 миллилитровую коническую трубку, содержащую раствор MV-1 на льду, и используйте миппы для извлечения гипофиза из селлы турцики черепа. Поместите гипофиз в 1,7 миллилитровую микроцентрифугную трубку раствора MV-1 на льду и удалите кожу и мышцу, чтобы разоблачить позвоночник.
После удаления конечностей, грудной клетки и внутренних органов, используйте 10 миллилитров шприц оснащен 18 калибровочной иглой, чтобы промыть позвоночный столб со свежим раствором MV-1, в хвостовой к росттральному направлению по всему поясничному позвоночному foramen. Затем поместите спинной мозг в 5 миллилитровую трубку, содержащую свежий раствор MV-1. Затем поместите мозг в чашку Петри под рассеченным микроскопом и удалите околение двойным уколом.
Не забудьте проверить спинной мозг, чтобы убедиться, что никаких кусочков околиний не осталось. Используйте типсы, чтобы отделить гипоталамус, мозжечок, ствол мозга и кору. При необходимости используйте щипцы и радужную оболочку глаза и весенние ножницы, чтобы вырезать обонятельные луковицы и таламус, и использовать двойной укол, чтобы удалить все колото-нотовидное сплетение из всех желудочков мозга.
Для вскрытия тканей ЦНС из большого образца гиренцефалических позвоночных, используйте рассечение микроскопа и двойной кол, щипцы, и радужной оболочки глаза и весенние ножницы, чтобы удалить околение из каждой ткани ЦНС, заботясь, чтобы удалить любые куски хороидного сплетения из желудочков мозга. Для гомогенизации собранных тканей ЦНС, фарш каждого региона ЦНС в один-два миллиметра штук в отдельных чашках Петри. Для гомогенизации тканей ЦНС из мелких позвоночных образцов, используйте передачу пипетки, чтобы добавить один миллилитр раствора MV-1, чтобы приостановить фарш ткани.
Затем используйте ту же трубу для передачи коры головного мозга, мозжечка, ствола мозга, оптической доли и части спинного мозга в отдельные 10 миллилитровых стеклянных тканей шлифовальные машины, и использовать PTFE пестик и пять миллилитров MV-1 решение молоть каждый набор тканей около 10 ударов. Передача каждой ткани суспензии в отдельные 15 миллилитров конических труб на льду, и использовать типсы для места гипоталамус и гипофиза в 100 микролитров раствора MV-1, в отдельных 1,7 миллилитров труб. Затем тщательно гомогенизируйте каждую ткань стеклянным микропестлом.
Чтобы гомогенизировать большой образец позвоночных, используйте скошенную срезаную трубу для переноса рубленой ткани в мясорубку из 55 миллилитров стеклянной ткани и прикрепите мясорубку к накладным мешалке. Добавьте половину рекомендуемого объема раствора MV-1 в соответствии с конкретной частью ЦНС, гомогенизированной, как указано в таблице, и включите накладный мешалку примерно до 150 вращений в минуту. Тщательно перемести стеклянную трубку вверх и вниз в течение 30 секунд, прежде чем выключить накладные мешалки, чтобы добавить больше MV-1 решение для дополнительной однородности, пока однородный суспензии не будет получен.
Затем перенесите гомогенизированную ткань в 50 миллилитровую коническую трубку на льду. Для очистки микровесселя гранулы ткани ЦНС гомогенатов центрифугации, и отказаться от супернатантов. Для небольшой изоляции позвоночных образца микровессела, пипетки коры головного мозга, ствола мозга, оптической доли и гранул спинного мозга, в пяти миллилитров свежего, ледяного раствора MV-2 на образец, примерно в 10 раз, прежде чем добавить еще пять миллилитров ледяного раствора MV-2 в каждую трубку.
Тщательно переверните трубки, чтобы смешать, и повторно приостановить гипоталамус и гипофиза гранулы в один миллилитр раствора MV-2. Для большой изоляции микровесселя позвоночного образца добавьте 20 миллилитров ледяного раствора MV-2 в кору головного мозга, мозжечок, ствол головного мозга и гранулы микровесселя спинного мозга, а также повторно приостановите гранулы в трубчатом револьвере при 40 вращениях в минуту в течение примерно 5 минут. В конце повторной суспензии отделяйте ликаты ткани ЦНС центрифугой и медленно вращайте каждую трубку, чтобы супернатант прошел вдоль стенки, чтобы тщательно отделить толстый и плотный слой миелина от жидкого интерфейса от стенок трубки.
Отбросьте миелин и жидкие интерфейсы, и промокнуть внутреннюю стену каждой трубки шпателем, завернутый с низким ворса бумаги протрите. Затем используйте витую салфетку с низким ворсином, чтобы поглощать избыток жидкости, и используйте низкосвязные советы, чтобы повторно приостановить каждую гранулу в один миллилитр раствора MV-3. Для microvessel elution и фильтрации, смешать несколько миллилитров свежего раствора MV-3 для каждой ткани ЦНС микровессель суспензии, и при смешивании, чтобы избежать агрегатов, процедить каждую подвеску через ситечко Pruitt в отдельных 50 миллилитров конических труб.
Поместите один 20-метровый фильтр нейлоновой сетки на один модифицированный держатель фильтра в регионе CNS. Перенесите держатель фильтра на 50 миллилитровую коническую трубку и промокнете фильтр пятью миллилитров ледяного раствора MV-3, убедившись, что буфер льется вниз по держатель фильтра, в коническую трубку. Перенесите элеваторные микровессы на каждый 20-метровый нейлоновый чистый фильтр и промойте микровесы 5-10 миллилитров ледяного раствора MV-3.
Используйте типсы для переноса каждого фильтра в отдельные стаканы, содержащие ледяной раствор MV-3, и аккуратно встряхните каждый фильтр в течение 30 секунд, чтобы отделить микровессы. После перехода на 15 миллилитровую коническую трубку, соберите микровессы путем центрифугации и используйте низкообязательную пипетку, чтобы повторно приостановить каждую гранулу в одном миллилитре ледяного раствора MV-3. Затем перенесите микровесячные суспензии из мелких позвоночных образцов в 1,7 миллилитровую микроцентрифугную трубку для центрифугации в течение пяти минут при 20 000 раз G, в четыре градуса цельсия.
Для крупных позвоночных образцов перенесите суспензию в отдельные пятими миллилитровые центрифуги и добавьте четыре миллилитров раствора MV-3 для центрифугации в течение пяти минут при 2000 раз G при четырех градусах Цельсия. Внутренние компоненты нервно-мышечного блока могут быть обнаружены в микровесселях, изолированных, как попродемонстрировано, путем иммунолабеля для CD31, PDGFR-бета и аквапорина четыре, в том числе корковых, мозжечковых, гипофиза, гипоталамии, ствола мозга и спинного микровессел. Точно так же можно визуализировать экспрессию придерживается-соединения белка VE-кадерин, плотных белков соединения CLDN5 и Зонула Окклюденс-1, трехклеточного соединения белка ангулина-1 и базальных меток хемокина лиганда CXCL motif 12 и гамма-глутамильтрансферазы-1.
Кроме того, большинство микровесселей лишены выражения альфа-гладкого мышечного актина, что указывает на то, что этот протокол изоляции избирательно нацелен на малокалиберные микровесы. Микровессели, полученные от других мелких лиссенцефалических позвоночных, таких как птица, лжец, лягушка и рыба, имеют некоторые морфологические особенности, предполагая, что этот метод полезен для дальнейшей характеристики различий в нервно-сосудистых единицах между видами. Количественная оценка изменений в экспрессии белка показывает увеличение молекулы адгезии сосудистой клетки один, и соединение молекулы адгезии B вдоль микровесселей спинного мозга, во время пика экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.
Тем не менее, молекулы адгезии сосудистой клетки один также значительно увеличивается в гипофиза микровесселей, и уменьшилась в гипоталамус и ствол мозга микровесселей. Кроме того, изменения наблюдаются в молекуле адгезии сосудистой клетки одним выражением во время хронического экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита во всех тканях ЦНС, а также в экспрессии молекулы адгезии В в гипоталамусе и микровесселях гипофиза. Количественные анализы, такие как западная помарка, ПЦР и иммуногистохимия, могут быть выполнены после этой процедуры, чтобы выявить понимание генов и моделей экспрессии белка в рамках геммоокно-мозгового барьера.
Параформальдегид является остро токсичным реагентом, и всегда должны быть обработаны под капотом дыма во время ношения надлежащего СИЗ.
