Редактирование генов CRISPR/Cas9 у слабо электрических рыб, особенно в сравнительном контексте, позволит исследователям проверить гипотезы о том, как специфические гены и генетическая дисперсия способствуют фенотипическим вариациям. CRISPR/Cas9 является эффективным методом генерации мутантных эмбрионов F-zero. Этот протокол позволяет исследователям проводить манипуляции CRISPR-Cas9 в двух конвергентно эволюцию видов слабо электрических рыб.
Ключом к использованию этого подхода с некоторыми изменениями в других электрических рыб или других видов рыб является наличие транскриптомных или геномных ресурсов для сделать sgRNAs. Выполнение микроинъекций и визуализация клеток в 3D-месте в 2D плоскости может быть затруднено. Получить небольшую колонию зебры для яиц на практике общих методов микроинъекции.
Демонстрацией процедуры с Саввасом Константину будет Джаред Томпсон, техник из моей лаборатории. После жилья видов рыб, представляющих интерес в соответствующих условиях размножения, определить самок рыб, которые появляются gravid. В B.gauderio, самка будет иметь опухшие гонады просто caudal в вентиляционные отверстия.
В B.brachyistius самки будут иметь опухшие животы и появляются глубокотелые. После введения анестезии добавьте нерестовой агент в четыре раза больше DPBS в трубку ПЦР с тщательным смешиванием. Раствор станет облачным.
Используйте пипетку, чтобы измерить рассчитанную дозу и обойтись разбавленного агента к куску термопластика, прежде чем рисовать раствор в точный стеклянный шприц оснащен 28-го калибра от 19 до 25-миллилитровой длины скошенной иглы. Ввимите раствор в мышцу спинного туловища с гладкой скоростью и дайте игле сидеть в течение двух-четырех секунд до удаления. Затем немедленно поместите рыбу в пресную воду системы для восстановления.
Для сбора спермы B.gauderio, через 24 часа, выберите большую мужскую рыбу и как можно быстрее после одации, тщательно высушите рыбу, особенно вокруг головы и Вента. Поместите высушенную рыбу брюшной стороны вверх, передней слева в соответствующий держатель, покрытый MS222 пропитанной влажной бумажное полотенце с головой, как параллельно со столом, как это возможно. Немедленно нанесите давление в caudal к rostral направлению с светом сжимая немедленно над gonads к вентиляции и используя micropipetter с подсказкой, тщательно собираете сперму по мере того как она сжата от мужчины в 50-microliter приращениях.
Добавьте алицит спермы непосредственно на 500-микролитерные объемы раствора расширитея спермы на льду. Сразу после сбора поместите рыбу в слизь пальто защиты продукт-обработанной пресной системой воды. Для сбора яиц B.gauderio, после высыхания обезболивающей самки рыбы B.gauderio, немедленно поместите рыбу на бок с головой, обращенной к недоминной руке, и нанесите давление в хвостовом направлении с легким сжатием medially над гонадами к вентиляции.
Используя инструмент политетрафторэтилен, тщательно собирайте яйца, как они выдавливаются из клоаки и быстро поместите яйца в небольшой крытый Чашку Петри. Если вы работаете в одиночку после сжатия, коснитесь яичной массы к основанию небольшой чашки Петри, как они изгнаны из женщины. Сразу же после сбора яиц, поместите рыбу в слизь пальто защиты продукт-обработанной пресной воды системы.
Для экстракорпорального оплодотворения B.gauderio добавьте 100 микролитров хорошо смешанного раствора спермы SES непосредственно над яичной массой, а затем один миллилитр пресной воды системы. Смешайте подвеску gametes тщательно в течение 30 до 60 секунд, прежде чем добавить дополнительный один-два миллилитров 0,22-микрометровой поры фильтрованной системной воды в клетки. Этикетка блюдо с временем экстракорпорального оплодотворения и поместите блюдо в 29-градусный инкубатор по Цельсию, установив 50-минутный таймер, чтобы проверить ход развития.
В период оплодотворения используйте наконечник пипетки микрозагрузщика, чтобы перезагрузить два микролитров инъекционного раствора, представляющих интерес, в микроинъекцию иглы и изгнать жидкость как можно ближе к кончику. Когда одна клетка сформировалась на полюсе животного по крайней мере одной клетки, перенесите блюдо под рассеченный микроскоп и используйте пару тонких щипцы, чтобы сломать кончик иглы под скошенным углом к тому, где конус иглы начинает демонстрировать жесткость. Отверстие иглы должно оставаться как можно меньше при сохранении жесткого конуса.
Определите развивающиеся зиготы под микроскопом и используйте пластиковую трубку передачи с разрезом наконечником, чтобы поместить от 10 до 20 яиц в как можно меньше воды на краю слайда стеклянного микроскопа, установленного в перевернутой верхней части чашки Петри. Используя деликатную протрите задачу, осторожно нажмите слайд, чтобы удалить избыток воды, чтобы яйца прочно прилипли к краю слайда. Вода будет злой под слайдом и тянуть яйца к краю.
Там должно быть достаточно воды, чтобы держать яйца влажными, сохраняя при этом мало влаги стоя, чтобы избежать движения яйца во время инъекции. Выровняйте яйца против слайда вертикально, перпендикулярно приближающейся игле, и используйте микроманипулятор, чтобы распоставить иглу против хориона. Затем, держа иглу под примерно углом 45 градусов, вставьте кончик сначала в хорион, а затем, в одну клетку, впрыскивает через желток, если это возможно.
Удалите все сломанные яйца во время инъекции с тонкой типсов. Когда все яйца были введены, используйте шприц бутылку 0,22-микрометровой поры фильтрованной системной воды, чтобы аккуратно промыть яйца от стадии инъекции в новую 100-миллиметровую чашку Петри. После успешного краткого руководства RNAs отбора и синтеза, в пробирке расщепления могут быть проверены для выбора для одноклеточных микроинъекций.
После очистки и клонирования ПЦР в этом репрезентативном эксперименте индуцированные мутации CRISPR-Cas9 были выявлены в отдельных клонах B.gauderio и B.brachyistius с сильным снижением амплитуды разряда электрического органа, в то время как неинъекционные элементы управления отображали только ссылающиеся генотипы. Визуализация амплитуды разряда электрического органа между подтвержденными мутантами CRISPR и размером агента, сочетаемой с необъективными управлениями, показала, что оба мутанта SCN-4 AA B.brachyistius и B.gauderio имели значительно более низкие амплитуды разряда электрических органов, чем элементы управления. При выполнении микро-инъекций, двигаться как можно быстрее и намеренно, чтобы максимизировать количество одноклеточных инъекционных эмбрионов, которые выживают.
Не тратьте время на сложные яйца. После того, как успешные мутанты были определены, традиционные методы разведения могут создать стабильные линии мутантов, которые устраняют связанные с CRSPR проблемы мозаичности. Этот протокол позволит исследователям провести сравнительные геномные исследования с функциональной проверкой в двух конвергентно эволюцивах видах слабоэлектри электрических рыб.
