3D органоидная система считается более физиологически актуальной, чем 2D анализы, и она может предоставить ценную информацию о биологии, которая в противном случае было бы сложно приобрести. Это адаптируемая система, в которой мы можем тестировать фармакологические и генетические манипуляции с меньшим временем и значительно меньшими затратами, чем при использовании подхода in vivo. Матрица суда очень сложно справиться, как она затвердевает, когда она достигает комнатной температуры.
Его можно протянуть через пипетки только тогда, когда он жидкий и должен поддерживаться на льду. Целостность кольца имеет важное значение для поддержания. Если структура нарушена, что может негативно повлиять на рост органоидов, и вы можете легко потерять материал при изменении средств массовой информации.
Начните эту процедуру с подготовки мыши базальных и светящихся эпителиальных клеток простаты, как описано в текстовом протоколе. Вымойте клеточные гранулы в 500 микролитров органоидных средств мыши, а затем повторно приостановить гранулы при плотности клеток 1000 клеток на микролитер. Чтобы подготовить мастер смеси, смешать эпителиальные клетки приостановлено в мыши органоидных средств массовой информации с матричным гелем для создания окончательной смеси, которая содержит 25%клеток в средствах массовой информации и 75%матричный гель.
В зависимости от применения вниз по течению, базальные клетки, как правило, потрохаются в концентрации от 100 до 2000 клеток на 80 микролитров, в то время как светящиеся клетки поцаращраются в концентрации от 2000 до 10 000 клеток на 80 микролитров. Для каждой клеточной смеси добавьте 80 микролитров матричного геля на колодец пластины из 24 колодец. Пипетт капли на нижнюю половину стенки хорошо, избегая при этом прямого контакта с поли-гема покрытия.
После добавления матричного геля, вихрем пластины, чтобы матрица гель клеточной смеси, чтобы сформировать кольцо вокруг обода хорошо. Поместите 24-хорошо пластины в 37-градусный по Цельсию, 5%C02 инкубатор правой стороной вверх в течение 10 минут, чтобы матрица гель частично затвердеть. После инкубации в течение 10 минут, переверните 24-хорошо пластины вверх дном и инкубировать в течение еще 50 минут, чтобы матрица гель полностью затвердеть.
Затем добавьте 350 микролитров предварительно разогретых органоидных средств массовой информации мыши в центр каждой хорошо. После добавления средств массовой информации, вернуть 24-хорошо пластины в инкубатор. Для пополнения мыши органоидных средств массовой информации, наклонить 24-хорошо пластины под углом 45 градусов, и осторожно удалить существующие средства массовой информации из центра каждой хорошо с помощью P1000 пипетки, избегая при этом кольцо матричного геля.
Добавьте 350 микролитров предварительно разогретых органоидных средств мыши, как и раньше. Рекомендуется добавить больший объем средств массовой информации в органоиды, культурные в течение более пяти дней, чтобы предотвратить быстрое истощение ключевых питательных веществ и факторов роста. Удалите мультимедиа из каждого хорошо, как и раньше.
Для сбора органоидов, неоднократно взрыва матричного геля путем пипетки один миллилитр предварительно разогретых диспаза-содержащих средств массовой информации непосредственно на кольцо матричного геля, пока все кольцо выбили. Перенесите выбитую матричную органоидную смесь геля в 1,5-миллилитровую микро-центрифугу. После полного пищеварения, как описано в текстовом протоколе, добавьте фосфатный буферный солевой раствор в органоидные гранулы и повторно приостанавливайте, мягко стряхивая.
Пеллет органоидов центрифугации при 800 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре, и удалить супернатант с помощью микро-пипетки. Повторно приостанавливайте органоидные гранулы в 100 микролитров буфера белкового лиза на 10 микролитров объема упакованных клеток. Флик повторно приостановить.
Теперь, sonicate органоидов путем погружения труб во влажный лед и осторожно применяя кончик звукового dismembrator на внешней стороне микро-центрифуги трубки. Sonicate в течение 40 секунд на 20 килогерц, прежде чем приступить к западной blotting с установленными протоколами. Для сбора органоидов простаты из 24-хорошо пластин, удалить средства массовой информации из каждого хорошо, как и раньше.
Дайджест матричного геля путем инкубации с 500 микролитров диспаза-содержащих средств массовой информации в течение 30 минут в 37-градусный по Цельсию, 5%CO2 инкубатор. Соберите переваренную органоидную суспензию в микро-центрифуге трубки. Затем гранулы органоидов центрифугации в 800 раз G в течение трех минут при комнатной температуре, и удалить супернатант.
Для выполнения цельно-монтажного иммунофлуоресцентного окрашивания органоидов простаты, сначала добавьте 500 микролитров 4%параформальдегида в PBS. Инкубировать органоиды в течение двух часов при комнатной температуре с нежной тряской. После мытья гранулы, как описано в текстовом протоколе, добавьте один микрограмм на миллилитр пятна DAPI в блокирующий раствор и инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре.
Защитите образец от света во время инкубации от этого шага вперед. После центрифугации органоидов, как и прежде, добавить первичные антитела в блокирующий раствор и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию с нежной тряской. Пеллет органоиды снова, и мыть гранулы с одним миллитером PBS в течение 15 минут с нежной тряски.
Повторите эту процедуру стирки два раза. Затем добавьте вторичные антитела в блокирующий раствор и инкубировать на ночь при четырех градусах цельсия с нежной тряской. После инкубации, гранулы органоидов, и мыть гранулы еще два раза.
Добавьте один миллилитр 30% сахарозы в PBS с 1%Triton X-100 к гранулированному органоиду. Затем инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре с нежной тряской. После гранулирования органоидов снова, добавить один миллиметр 45% сахарозы в PBS с 1%Triton X-100, и осторожно встряхнуть в течение двух часов при комнатной температуре.
Затем повторите процедуру, за исключением добавить один миллилитр 60% сахарозы в PBS с 1%Triton X-100. Пеллет органоидов центрифугации при 800 раз G в течение трех минут при комнатной температуре, и удалить 95% супернатанта. Наблюдайте гранулы под ультрафиолетовым светом, чтобы подтвердить, что она не была потеряна во время удаления супернатанта.
Гранулы становится слабее, как концентрация сахарозы становится выше. Перенесите от 10 до 20 микролитров оставшейся подвески на камерную крышку и приступайте к конфокарной микроскопии. Базальные и светящиеся клетки образуют органоиды с различными морфологиями.
В то время как большинство базально-полученных органоидов похожи по размеру после семи дней в культуре, органоиды, полученные с люминалом, обладают значительной неоднородностью. Кроме того, большинство базально-производных органоидов содержат люмены, окруженные многослойным эпителием, в то время как органоиды светимого происхождения варьируются в морфологии от полых с однослойным эпителием до твердых с многослойными шнурами клеток, которые не канализируются. Западный анализ помарки показал, что базальные и светящиеся органоиды сохраняют черты, связанные с базальными и светящимися первичными клетками.
Базально-производные органоиды выражают более высокие уровни базального маркера цитокератина 5, в то время как органоиды светимого происхождения выражают более высокие уровни цитокератина светимого маркера 8. Оба базальных и светящихся маркеров были обнаружены в базальных и светящихся полученных органоидов в основной популяции, возможно, наводящий на дифференциацию. Базально-производные органоиды содержат многослойный эпителий, с внешними слоями, выражают высокие уровни базального маркера p63, а внутренние слои имеют необнаметенные уровни.
Внешние слои также выражают умеренные уровни светимого маркера цитокератина 8, а внутренние слои имеют высокие уровни. В то время как все клетки в однослойных светящихся органоидов пятно положительно для цитокератина 8, только избранные клетки, содержащиеся ядерные p63. Необходимо позаботиться при обработке матричного геля, чтобы убедиться, что он не затвердевает до покрытия клеток в органоидной культуры.
DAPI, используемый для микроскопии, может вызвать раздражение кожи. УФ-излучение также может быть вредным. Необходимо иметь достаточное оборудование для индивидуальной защиты.
Мы можем собирать РНК из органоидов для выполнения секвенирования РНК, что расскажет нам о том, как меняются профили экспрессии генов во время формирования органоидов или в ответ на манипуляции. Эта модель позволила области простаты иметь воспроизводимые ex vivo анализ для изучения фундаментальных аспектов эпителиальной биологии и выявления регуляторов в развитии и дифференциации.
