Этот метод является надежным способом доставки любого содержания, таких как наркотики, белки или клетки в определенных местах в тканях или животных. Вы можете отслеживать доставку и настроить выпуск содержимого в соответствии с экспериментом вы хотите. Он может быть использован для лечения многочисленных заболеваний от заживления ран до глазных и сердечных заболеваний.
Основным преимуществом этого метода является способность доставлять терапевтические клетки с использованием альгинатных микрокапсул к целевым объектам, не вызывая никаких иммунных реакций и поддерживать устойчивую доставку свежих секретных терапевтических средств в течение более длительного периода времени. Начните с культивирования эпителиальных клеток сетчатки в соответствии с рукописными указаниями. Прохождение клеток, когда они достигают 70 до 80% слияния с помощью стандартных процедур культуры тканей.
Чтобы инкапсулировать клетки, смешать альгинат натрия с деионизированной водой для окончательной концентрации 2%weight к объему и очистить смесь с помощью фильтрации с 0,2 микрометра стерильного шприца фильтра. Трипсинизировать, центрифугу и промыть клетки 10-миллиметровым гелевые растворы HEPES. Используйте гемоцитометр, чтобы подсчитать клетки и настроить окончательную концентрацию клеток до одного миллиона на один миллилитр альгинатного раствора.
Загрузите 300 микролитровых алицитов алгината и клеток в три миллилитровых шприца и прикрепите его к шприц-насосу. Подготовь гелеобразную ванну в соответствии с рукописными указаниями и поместите ее в стерильный стакан на 50 миллилитров ниже кончика шприца на семимиллиметровой игле на расстояние распыления ванн. Отрегулируйте напряжение до восьми киловольт и скорость потока до 30 миллиметров в час для производства микрокапсул размером около 150 микрометров.
Подключите черный молотый зажим к медной проволоке, которая на полпути погружена в гелеобразную ванну, и соедините зажим красного анодного провода с иглой. Это займет около 30 минут, чтобы подготовить инкапсулированные клетки из каждой миллилитр партии альгината и клеточной смеси. При форме, мыть микрокапсулы с раствором для мытья в два раза и инкубировать их с 10%FBS дополнены DMEM средств массовой информации во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию и 5%CO2.
После 24-часовой инкубации, подготовить 500 микролитер образец микрокапсул для окрашивания, мыть их дважды в стиральный раствор. Используйте LIVE / DEAD анализ комплект, чтобы запятнать их для жизнеспособности. Чтобы убедиться, что микрокапсулы имеют соответствующий размер, разбавьте их в средства массовой информации без сыворотки.
Тщательно аспирировать их шприцем Гамильтона 2,5 микролитров. Медленно выбросьте один микролитер падает на слайд микроскопа и определить целостность микрокапсул с помощью вертикального микроскопа Brightfield. В соответствующей анестезии мыши, применять глазной смазки для поддержания влаги глаз и использовать 26 калибровочных 3/8 дюйма скошенный шприц иглы для создания первоначального прокола глаза чуть ниже лимбуса.
Убедитесь в том, чтобы подойти к глазу с носового направления под углом 45 градусов, сохраняя скошенный кончик вверх, чтобы избежать перфорации объектива. Далее, убедитесь, что весь кончик иглы вставляется в глаз для генерации направляющий отверстия, но будьте осторожны, чтобы не путешествовать слишком далеко и прокол височной сетчатки. Как только это будет завершено, медленно втягивать иглу.
В микроманипуляторе поместите 27-го калибра тупой наконечник 2,5 микролитер Гамильтон шприц, который был заполнен капсульным раствором и выровнить иглу с первоначальным отверстием направляющий выступ. Держите голову животного в стабильном положении и намеренно маневр иглы к глазу. Чтобы обеспечить правильное положение иглы в стекловидном состоянии, вставьте шприц до тех пор, пока кончик иглы не будет визуализирован за объективом.
Затем ввимите раствор капсулы медленно в течение 25-30 секунд. И как только завершено, постепенно втягивать тупой кончик шприца для того, чтобы свести к минимуму травмы глаза. При необходимости отрегулируйте размер капсулы, регулируя напряжение и скорость потока в соответствии с рукописными указаниями.
Инкапсуляция клеток в альгинате была подтверждена с помощью изображения Брайтфилда, и анализ LIVE/DEAD показал, что 90% клеток были жизнеспособными после инкапсуляции. Долгосрочная жизнеспособность клеток обеспечивается растворением капсул в цитрате натрия и покрытием. Интравитреальная инъекция проводилась при визуальном осмотре, что позволяло визуализировать капсулы в стекловидном состоянии.
При попытке этой процедуры, не используйте PBS для любых шагов стирки, потому что PBS растворяет сформированные альгинатные микрокапсулы. После своего развития, наша лаборатория используется в качестве системы доставки для лечения форм сердечной недостаточности и гипертонии. Этот метод считается перспективным инструментом для будущего лечения различных сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний.
