Одноклеточный микро-аспирации является методом в дополнение к различным методам, используемым в области микробиологии в целом и в вирусологии в частности. Он мог бы ответить на ключевой вопрос и решить проблемы, с которыми сталкиваются во время изоляции гигантских вирусов, отделяя вирус от вирусной смеси, представляя низкий уровень изобилия Вирус, как это было в случае оборота вирусов, кланового вируса, и uzibati вирус от другого, который является Фаустовирус, присутствует в высоком изобилии в любом случае. Основным преимуществом такого подхода является использование косвенной стратегии.
Она состоит из разделения и клонирования инфицированного хозяина для получения вирусного разделения. Таким образом, этот метод отслеживает различные шаги от захвата до высвобождения клеток и подтверждает процесс сортировки микроскопическим наблюдением. Наконец, молекулярная биология используется для подтверждения сортировки и электронной микроскопии для наблюдения за разделенными вирусными частицами.
Такой подход позволит решить основную проблему разделения вирусов. Это перспектива для клонирования амебы или клонирования протистов в целом. Человек, который пытается использовать эту технику в первый раз должны быть строгими и точными при контроле давления.
Визуальный контроль необходим для подтверждения захвата и выпуска только одной ячейки. Используйте Vermamoeba Vermiformis, штамм CDC 19, в качестве поддержки клеток. Добавьте 30 миллилитров среды PYG и три миллилитров амебы при концентрации один раз десять- до шестой клетки на миллилитр в колбе культуры 75 квадратных сантиметров.
Поддерживайте культуру на уровне 28 градусов по Цельсию в инкубаторе. После 48 часов, передача 10 миллилитров амебы клеточной культуры на счет слайда и поместить его под микроскопом для количественной оценки амебы. Чтобы промыть, урожай 30 миллилитров клеточной культуры в трубке и гранулы амебы центрифугации при 720 раз G в течение 10 минут.
Удалить супернатант и повторно гранулы в соответствующем объеме голодания среды для получения концентрации один раз 10 до шестой клетки на миллилитр. Подготовье клеточной поддержки с добавлением противомикробного препарата. В кабинете биобезопасности, добавить один раз 10 к шестой амебы культуры в два миллилитров голода среды.
Затем привить 100 миллилитров фондового раствора, содержащего смесь вирусов в амебной клеточной культуры поддержки при множественности инфекции 0,01. Инкубировать инфицированных амебных клеток поддержки культуры. Добавить 30 градусов по Цельсию в течение 10 до 14 часов или до тех пор, пока цитопатические эффекты индуцируются, такие как амебал округливания или лиза.
Затем используйте шприц для сбора мультимедиа и фильтрации через фильтр из пяти микрон для удаления клеточного мусора. Выполните разбавление зерновых вирусного образца в голодании среды в различных скважинах. Прививают два миллилитров по одному разу от 10 до шестого Vermamoba Vermaformis, содержащихся в каждой чашке Петри со 100 миллилитров смеси inoculum.
Затем поместите посуду Петри в герметичным полиэтиленовым пакетом при 30 градусах по Цельсию. В шесть часов после заражения наблюдайте за блюдами Петри с перевернутой оптической микроскопией и проверяйте морфологию клеток каждые четыре-восемь часов. Антимикробное лечение для клеточной поддержки.
Выберите среди чашек Петри те, отсутствует каких-либо визуальных загрязнений грибковых и бактериальных агентов и с доказательствами цитопатический эффект амеб из-за вирусов и с предварительной лиза и округление фазы амеб, чтобы избежать аспирации вирусных частиц. Настройка рабочей станции с микро-манипулятором, устройством ручного управления давлением, перевернутым микроскопом, модулями Plug и Play Motor, камерой и компьютерным модулем. Выберите микро капилляр диаметром 20 микрон, чтобы обеспечить содержание внутреннего положения и легкое высвобождение клетки.
Зафиксирование угла работы системы захвата на моторизованном модуле при 45 градусах. Выполните двойную установку, сначала на системе захвата, а затем на микро капилляре. Сосредоточьтесь на клетках.
Чтобы клонировать клетки, поместите чашку Петри, содержащую два миллилитров инфицированных амеб под микроскопом. Сосредоточьтесь сначала на клетках, а затем на микрокатилляре, погруженной в культуру. Выбор округлых одноклеточных и приблизить микро капилляр к микроманипулятору.
Приложить мягкое стремление с ручным управлением давлением на клетку, принимая его внутри микро капилляров Удалить одну клетку из первого образца и освободить его в поддержку клеточной культуры амеб. Затем инкубировать его при 30 градусах по Цельсию. Тщательно контролировать давление, чтобы иметь возможность стремиться к одной клетке и контролировать свое стремление путем наблюдения освобождения одной клетки.
Проводите ежедневные наблюдения с помощью перевернутого оптического микроскопа, чтобы наблюдать за появлением клеток и следить за появлением цитопатический эффект. В настоящее время работает автоматизированная система экстракции для извлечения ДНК из части положительных образцов культуры, где наблюдается цитопатический эффект. Дизайн грунтовки для усиления бедных генов аннотированный как RBP2 для Фаустовируса, основные капсид белка usurpatvirus, и незначительные капсид белка для Clandestinovirus.
Выполните стандартный ПЦР с помощью термоциклера в соответствии с рукописью. Выполнить 20 микролилитров ПЦР реакций с 50 микромолярной каждой грунтовки, 1X Master Mix, и рибонуклеазы свободной воды. Запустите продукты ПЦР с пятном геля ДНК на 1,5%агарозный гель при напряжении 135 вольт и визуализировать с УФ. Этот протокол оптимизирует процесс микроманипуляции с одноклеточной микроаспирации.
Этот метод позволяет захватить округлую и зараженную амебу и ее выпуск в новой пластине, содержащей неинфицированные амебы. Этот подход успешно изолировал новый низкий изобилие гигантский вирус под названием Userpatvirus LCD7. Ваш Userpatvirus наблюдался только в клоне семь с наличием Userpatvirus LCD7 ДНК и отсутствие ДНК Фаустовируса.
Электронная микроскопия выявила появление кландестиновируса ST1, который имеет типичную морфологию icosahedral без фибрилляций, а также Usurpatvirus LCD7 с икозахедраловым капсидом около 250 нанометров. Низкая цитометрия подтверждает перекрытие популяций Фаустовируса и Навуара. После освоения, эта процедура может быть сделано легко.
Самое главное помнить при попытке этой процедуры является необходимость минимального ритуала наблюдения относительно размера лиц с хорошим обращением с компетентными рабочей станции и проверки любой проблемы загрязнения. Этот подход может быть использован в качестве метода сортировки на основе морфологии клеток. В настоящее время он используется в нашей лаборатории для клонирования конкретных амебы.
Одним из важнейших этапов этого метода является поддержание целостности клеток. Действительно, у нас могут быть некоторые проблемы с не наблюдением за ячейкой или освобождением. Это связано главным образом с распадом клетки на микро капилляры.
Этот метод может быть эффективной альтернативой, когда дефект телеметрии и сортировки фактов не доступны и когда конкретные ограничения техники достигнуты. Не забывайте, что в некоторых случаях клетка не высвобождается из микрокабрии. Отчасти это связано с характеристиками амеб и их способностью адаптироваться, а затем из клеточной мембраны.
