Этот протокол имеет важное значение, поскольку использование замороженных тканей упрощает логистику при оценке нескольких тканей, позволяет передать образец в удаленную лабораторию для анализа, и позволяет отложить решение об анализе ткани на месяцы. Основным преимуществом этой методики является то, что использование замороженных кубических тканей не требует персонала, обученного анализу кометы при некропсии, и минимизирует возможность технических ошибок и механических повреждений ДНК, введенных во время манипуляций с образцами. Этот метод имеет применение в доклинической разработке лекарственных средств, оценке безопасности химических веществ, поступающих в окружающую среду, и пищевых добавок.
Замороженные ткани могут быть использованы в анализе кометы для оценки генотоксического потенциала, восстановления ДНК, защитных эффектов от повреждения ДНК, вызванного химиотерапией или радиацией, а также для экологического био-мониторинга. В идеале, эксперименты должны быть разработаны, чтобы позволить обработки каждого образца ткани на шаг замораживания, прежде чем органы, собранные из следующего животного становятся доступными для обработки. Замороженные ткани могут быть предъявлены иск в комете анализ для оценки генотоксического потенциала, ремонт ДНК, защитные эффекты от повреждения ДНК, вызванного химиотерапией или радиацией, и для экологического био-мониторинга.
Технический тренер Кэрол Боббитт, и следственных токсикологии лаборатории менеджер Эйлин Гилас будет выступать в качестве прозекторов сегодня. Научный сотрудник Линкольн Мартин и специалист по гистологии Амели Лэдесеур будут демонстрировать обработку образцов. Чтобы начать эту процедуру, удалить любые прикрепленные соединительные ткани, органы и мусор из органа, представляющих интерес.
Сразу же свист органа энергично в среднем весят лодки, содержащие около семи миллилитров холодного, свежеприготовленного раствора для удаления остаточной крови и мусора. Перенесите орган на другую чистую весящую лодку, содержащую достаточный холодный раствор для доления ткани и поддержания ее на льду до дальнейшей обработки. Для печени, вырезать пять миллиметров продольной части левой доли и осторожно свист примерно в семь миллилитров холодного раствора минирования.
Затем поместите полосу ткани в чистую лодку среднего размера, содержащую около семи миллилитров холодного раствора для добытки и поддерживать на льду до готовности к дальнейшей обработке. Удалите участок печени и поместите его в встраиваемую кассету. Выполните фиксацию, обрезку и встраивание парафина в соответствии с лабораторными стандартными процедурами для возможной будущей оценки гистопатологии.
Для двенадцатиперстной кости, вырезать 10 миллиметров часть двенадцатиперстной кости проксимальной для желудка. Вставьте 21 до 25 калибровочных игл в одном конце двенадцатиперстной кишки и промыть его с одним миллилитр холодного раствора минирования для удаления любого мусора и бактерий. Переверните двенадцатиперстную монету, смойьте ее еще одним миллилитром раствора для норки и отбросьте иглу.
Нарежьте дуодена открытым и промыть его примерно в семь миллилитров раствора минсинга. Затем снова промыть двенадцатиперстную воду и поддерживать его в растворе для заминки на льду до готовности к дальнейшему обработке. Вырезать и исправить часть оставшейся двенадцатиперстной клетки для возможной будущей оценки гистопатологии, как ранее описано для печени.
Для мозга, это может быть полезно, чтобы сначала разделить мозг на два полушария, с одним полушарием сохраняется для возможной гистопатологии. Вскрыть области мозга интерес, а затем аккуратно промыть их, и поддерживать на льду в минный раствор, пока не готов к обработке дальше, как описано ранее для печени и двенадцатиперстной клетки. Для желудка, удалить и отказаться от forestomach.
Разрежьте железистый желудок, и мыть его свободным от пищи, свистя его в среднем весят лодки, содержащие около семи миллилитров холодного буфера минирования. Удалите пятимиллиметровую полоску железистого желудка проксимальной к двенадцатиперстной кости для фиксации для возможной оценки гистопатологии, как описано ранее. Поместите оставшийся желудок в лодку среднего размера, содержащую около семи миллилитров холодного буфера минирования и инкубировать на льду в течение 15 до 30 минут.
После этого перенесите желудок на чистый кусок парафина и используйте лезвие скальпеля или пластиковый клеточный скребок, чтобы аккуратно очистить поверхностный эпителий по крайней мере два раза, чтобы удалить мусор. Возьмите слизистую оболочку желудка с типсами и используйте пипетку, чтобы промыть ее одним миллилитром холодного буфера. Перенесите промытую ткань желудка на чистую поверхность или блюдо и добавьте холодный раствор для норки.
Используйте заднюю часть лезвия скальпеля или пластиковый скребок клеток, чтобы тщательно соскребать эпителий желудка четыре-пять раз, чтобы освободить клетки. Затем используйте пипетку для сбора раствора, содержащего высвобождаемые клетки, и перенесите его в микроцентрифугную трубку на льду. Для проема образцов тканей вырежьте участок печени, мозга или двенадцатиперстной клетки и перенесите его в помеченную микроцентрифугную трубку, содержащую один миллилитр холодного раствора минирования.
Используйте ножницы для быстрого фарша образца до тех пор, пока он, наконец, рассеивается, обеспечивая при этом, что образец остается холодным. Образец должен выглядеть немного облачно. Тем не менее, она является общей для некоторых частей, чтобы остаться, что будет поселиться на дне трубки.
Чтобы использовать ткань, пока она свежая, поддерживать трубки, содержащие образцы на льду. Чтобы заморозить образцы тканей, закрепейте крышку трубки сразу после сбора или сбора и опустите трубку в колбу Dewar, содержащую жидкий азот. По завершении сбора тканей используйте ковш для извлечения пробных трубок и поместите их на сухой лед для сортировки.
Перенесите трубки в морозильную камеру на сухом льду и храните коробку в морозильной камере при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы подготовить замороженные кубики ткани, нарежьте несколько мелких кусочков ткани и индивидуально опустите их прямо в лодку среднего размера или другой подходящий сосуд, содержащий жидкий азот в течение нескольких секунд. После того, как кусочки полностью замерзли, перенесите кубики замороженных тканей индивидуально на помеченные микроцентрифуговые трубки, или криотрубы, на сухой лед.
По завершении сбора тканей перенесите трубки в морозильную камеру на сухой лед и храните коробку в морозильной камере при температуре минус 800 градусов по Цельсию. При использовании свежевырубленной или выцарабленной ткани, сохраняемой на влажном льду, подготовьтесь к кометным горкам в течение часа после сбора урожая. При использовании замороженных фарш или Царапины ткани, место трубки замороженных тканей в ванну для воды при комнатной температуре, пока образцы полностью оттаяли, обеспечивая при этом, что они хранятся холодно.
После того, как образцы оттаяли, немедленно перенесите трубки на лед. Для кубовой ткани, получить трубки, содержащие кубики из морозильной камеры и поддерживать на сухом льду до подготовки слайда. Aliquot один миллилитр среды купца или минный раствор в помечены 1,7 миллилитров микроцентрифуг трубки для каждого образца и поддерживать на льду.
Работая быстро, чтобы избежать оттаивания, поместите куб ткани в открытый конец прибора для заминки тканей комнатной температуры. Быстро вставьте размер соответствует шприц поршень в устройство, чтобы подтолкнуть ткани в конце сетки, которые затем должны быть помещены в микроцентрифуг трубки, содержащей холодный раствор минирования. Погрузите сетчатый конец устройства в течение примерно 5-10 секунд в холодный раствор для норки, чтобы ткань полностью оттаяла.
Полностью угнетать поршень, пока клетки не видели экструдирования через поры сетки. Затем потяните поршень примерно на 2,5 сантиметра и нажмите вниз снова полностью. Повторите несколько раз, пока раствор норки не станет мутным.
Для подготовки слайдов аккуратно смешайте подвеску клетки и перенесите 50 микролитров в трубку, содержащую 450 микролитров 0,5%low melting point agarose при 37 градусах Цельсия. Подготовка и оценка слайдов, изложенных в текстовом протоколе. В первом исследовании, печень была собрана из двух когорт мужчин Sprague Dawley транспортного средства управления крысами пошатнулся на одну неделю.
Слайды готовили из свежевырубленной ткани, замороженного фарша и замороженной кубильной ткани. Поскольку ОЭСР рекомендовала верхний предел для процентной ДНК хвоста в свежей крысиной печени составляет 6%,эти результаты показывают, что любой из методов замораживания может хорошо работать для оценки тканей. В целом, процент ежей параллельно процент хвост ДНК, хотя замороженные ткани выставлены больше изменчивости.
Во втором исследовании самка мышей B6C3F1 управлялась транспортным средством или метансульфонатом мутагена этила. Процентные результаты ДНК хвоста показывают, что ткани печени заморожены в виде кубов, а затем обработаны с помощью ткани доносясь устройства дали результаты очень похожи на те, которые получены для свежевырубленной ткани. Статистически значимое увеличение индуцированных EMS повреждения ДНК было измерено в образцах тканей, обработанных всеми тремя методами.
В третьем исследовании были проанализированы образцы печени, взятые у самок мышей B6C3F1 в ходе 90-дневного исследования химической токсичности. Повреждение ДНК в замороженном фарше ткани было высоким во всех дозах групп, с существенным животных к животной изменчивости. Процент ДНК хвоста результаты коррелируют с процентом ежей, что свидетельствует о том, что ежи внесли существенный вклад в высокий уровень повреждения ДНК, который наблюдался в этих образцах.
В отличие от этого, как ДНК поврежденных и процентов ежей были очень низкими во вспышке замороженных кубов ткани, которые были подготовлены параллельно с рубленой ткани образцов. Таким образом, сильно поврежденные клетки, проявляющиеся в виде ежей в образцах рубленой ткани, явно не были результатом биологического процесса, но, вероятно, были введены механическим нарушением, и, или потепление тканей во время процедуры рубки до вспышки заморожены. Поэтому данные по рубленой ткани были признаны недостоверными.
Для сравнения, высококачественные данные были получены из замороженных кубовых тканей, даже после длительного хранения. Очень важно сохранить собранные ткани холодными и влажными, и работать быстро, чтобы заморозить образцы. Кроме того, замороженные кубические ткани должны быть разморожены непосредственно перед этапом гомогенизации.
Образцы замороженных тканей подходят для других приложений ниже по течению, включая, например, модификации анализа кометы для обнаружения окислительного повреждения или перекрестной связи, а также оценку изменений в экспрессии генов. Осторожность следует проявлять при обработке скальпеля лезвия для разреза или соскребать ткани, и при обработке жидкого азота во время процесса замораживания.
