Мы разработали простой метод для тестирования образцов пищи для различных токсинотипов C perfringens. Мы особенно заинтересованы в распространенности токсинотипов B и D, которые производят токсин эпсилона. Наш протокол позволяет легко обогащения и обнаружения различных C perfringens токсинотипов без использования анаэробных камер или инкубаторов с ограниченным суб-культа.
Этот метод также может быть использован для проверки почвы, воды, фекальных образцов и многое другое. Демонстрацией процедуры будут Зуха Анвар и Саманта Риган, специалисты из лаборатории. Начните с подготовки модифицированных быстрых perfringens среды, или RPM.
Комбинат ингредиентов в соответствии с рукописными направлениями, и автоклав смеси при 121 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Разрешить среде остыть примерно до 40 градусов по Цельсию, а затем добавить D-циклозерин к конечной концентрации 440 миллиграммов на литр. Асептически перенести RPM на 15 миллилитров конических трубок, и хранить при четырех градусах по Цельсию на срок до одного месяца.
Перед использованием, тепло среды до 37 градусов по Цельсию. При сборе образцов для тестирования перенесите пищу в лабораторию в соответствии с рукописными указаниями. Если не тестирование немедленно, пища может храниться при минус 20 градусов по Цельсию.
Обратите внимание на тип продуктов питания и страну происхождения, а также любую другую соответствующую информацию. Чтобы проверить пищу, перенесите примерно один-два грамма в стерильную чашку Петри и мелко измельчите ее стерильным лезвием бритвы или скальпелем. Привить его в 10 миллилитров PBS в 15 миллилитров конической трубки, и хорошо перемешать.
Выберите для вегетативных клеток путем передачи пяти миллилитров пищевой смеси PBS в 15 миллилитров конической трубки с 10 миллилитров RPM и плотно закрывая крышку. Выберите для спор, нагревая оставшиеся пять миллилитров смеси до 85 градусов по Цельсию в течение 15 минут. А затем передать его в трубку с RPM и плотно закрыть крышку.
Для обеспечения полного смешивания, вихря и инвертирования культур пищевых RPM. Затем плотно запечатайте конические трубки и оберните крышки парафиновой пленкой, чтобы создать анаэробную среду. Инкубировать трубки на ночь при 37 градусах по Цельсию и отметить любую мутность или брожение на следующее утро.
Подготовка триптозы сульфит циклосерин или TSC Агар в соответствии с направлением производителя, а затем использовать технику бутерброда, чтобы привить его с ночной культуры RPM. Подготовь базовый слой пластин, переведя 10 миллилитров расплавленного агара в стерильные блюда Петри и позволив ему затвердеть. Поддерживайте оставшийся TSC Agar при 40 градусах Цельсия для верхнего слоя и тщательно перенесите 100 микролитров ночной культуры RPM на базу Агара.
Некоторые культуры могут быть под давлением из-за брожения, так что не забудьте носить все соответствующие средства индивидуальной защиты. Распространение инокулина со стерильными стеклянными бусинами или клеточным распространитель, и позволяют RPM быть поглощены в Агар в течение пяти до 10 минут. Затем используйте серологическую пипетку, чтобы тщательно перенести 20 миллилитров расплавленного TSC Agar на тарелку.
Замените крышку чашки Петри и позвольте TSC Agar полностью затвердеть при комнатной температуре, затем инвертировать блюдо и инкубировать его при температуре 37 градусов по Цельсию на ночь. При необходимости выполняйте серийные разбавления культуры RPM до прививки в TSC Agar. После инкубации изучите пластины на бактериальный рост.
Аэробные бактерии могут присутствовать на поверхности Агара, в то время как анаэробные бактерии будут встроены в Агар. Сульфитовые уменьшающие бактерии превратят окружающий Агар в черный цвет, а возможные колонии C perfringens будут черными и встроены в агар. Если на поверхности пластины происходит плотный рост аэробных бактерий, используйте клеточный скребок для удаления колоний из выбранных областей.
Используйте стерильные одноразовые капельницы для глаз, чтобы сорвать подозреваемых C perfringens колоний из Агара, убедившись, что изгнать воздух до пирсинга Агар. Перенесите колонии на 10 миллилитров свежего RPM в 15 миллилитров конической трубки. Несколько колоний могут быть отобраны из одной пластины в отдельные культуры RPM.
Плотно закрепте конические крышки трубки, оберните их в парафиновую пленку и инкубировать их на ночь при 37 градусах по Цельсию. C perfringens является BSL два организма. Важно постоянно соблюдать надлежащие меры предосторожности, особенно при открытии ночных культур RPM, а также тщательно обеззараживать и утилизировать использованные средства массовой информации.
На следующий день, удалить ночные культуры и изучить их на мутность и брожение, а затем приступить к извлечению ДНК. Аккуратно инвертировать культуру RPM, чтобы разогнать любые оседлые бактерии и тщательно открыть трубку. Перенесите один миллилитр в микроцентрифугную трубку и гранулы бактерий центрифугации.
Вымойте гранулы с одним миллилитров стерильных PBS. Если непереваренный желатин поселился на вершине бактерий, пух его покинуть, агитирует с PBS. Аккуратно аспирировать желатин и PBS и повторно приостановить оставшиеся бактериальные гранулы с одним миллилитр свежего PBS.
Важно удалить любой гранулированного желатина с ограниченным нарушением клеточной гранулы. Неспособность удалить желатин может препятствовать извлечению ДНК и ПЦР. Центрифуга бактерий в течение 10 минут и тщательно аспирировать супернатант.
Затем выполнить экстракции ДНК с помощью комплекта, специально предназначенные для грамположительных бактерий. Используйте ДНК немедленно или храните ее при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Выполните ПЦР на извлеченной ДНК, чтобы определить, являются ли культуры положительными для C perfringens toxinotypes.
Используйте C perfringens ДНК в качестве положительного контроля для обеспечения того, чтобы все реагенты ПЦР работают. Запустите ПЦР в соответствии с рукописными указаниями и проанализируйте продукты с помощью электрофорезов агарозного геля. Этот протокол был использован для проверки в общей сложности 216 образцов продуктов питания, приобретенных в розничных магазинах Нью-йорка.
Образцы включали различные образцы мяса, образцы птицы и образцы морепродуктов. C perfringens Тип B был использован в качестве положительного контроля. Было установлено, что от 15 до 20% отобранных продуктов положительный результат на C perfringens.
Из 34 положительных образцов 31 образец содержал альфа-токсин, один образец содержал альфа,бета и токсин эпсилона. И два образца содержали альфа- и эпсилонический токсин. Мы разработали простой метод для тестирования образцов пищи для различных токсинотипов C perfringens.
Мы особенно заинтересованы в распространенности токсинотипов B и D, которые производят токсин эпсилона.
