Этот протокол генерирует данные высокой пропускной способности транскрипции отдельных клеток островка человека, которые могут быть использованы для изучения неоднородности ангромных клеток, выявления редкого типа клеток и регуляции генов при заболеваниях. Этот метод генерирует крупномасштабные данные одной ячейки, прост в использовании и имеет довольно короткое время обработки. Этот метод может быть применен к островки из других видов и профиль других свежеиспеченные ткани.
Тем не менее, протокол должен быть оптимизирован в соответствии с тканевыми процедурами диссоциации. Очень важно подготовить высококачественные диссоциированные клетки. КК клеточной подвески перед секционированием одной ячейки является ключевым фактором, как и тщательное и быстрое обращение с эмульсией.
Некоторые контрольно-пропускные пункты качества, такие как знание того, засорен чип, лучше видны, чем читаются. После получения человеческих островков и инкубации на ночь, подсчитайте и подбирайте 200-300 островков с помощью пипетки P200. Перенесите островки в 15-миллиметровую коническую трубку, содержащую пять миллиметров полного островкового средства, предварительно разогретую до 37 градусов по Цельсию.
Поместите трубку в центрифугу при 200 раз G в течение двух минут. Аккуратно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы на дне. Добавьте один миллиметр предварительно разогретого раствора диссоциации клеток и нарушить гранулы, мягко трубя вверх и вниз.
Инкубировать островки при 37 градусах по Цельсию в течение девяти-11 минут. Каждые три минуты, пипетка вверх и вниз медленно в течение 10 секунд, чтобы разобщить клетки в одиночные клетки. Как только островковых клеток хорошо разобщены и раствор становится облачным, добавьте девять миллилитров полного островка и процедите через 30-микрометровый ситечко клеток в новую 15-миллилитровую коническую трубку.
Соберите клетки путем центрифугации в 400 раз G в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно приостановить ячейки гранулы в 200 до 300 микролитров 1X PBS 04%BSA решения. Теперь смешайте 10 микролитров клеточной культуры с 0,5 микролитров АО/ДАПИ.
Pipette вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Загрузите 10,5 микролитров на слайд и запустите анализ количество ячеек на автоматизированном счетчике клеток на основе флуоресценции, чтобы определить количество и жизнеспособность. Поместите микрофлюидный чип в корпус чипа.
Ориентируй корпус чипа, гарантируя, что нефтяные скважины ближе всего к человеку, выполняя эксперимент. Используйте пипетку, чтобы добавить рассчитанный объем клеток в подготовленные полосы трубки. Пипетт смешать пять раз.
Не отбрасывая пипетки советы, передачи 90 микролитров клеточной смеси грести один из чипов. Подождите 30 секунд, затем пипетка очень медленно, чтобы загрузить 40 микролитров гелеобразного бисера на строку два. Раздать 270 микролитров перегородки нефти на скважины строки три.
Крюк чип прокладка на вкладки чипа держателя. Поместите собранный держатель чипа в одноклеточное устройство секционирования и нажмите кнопку запуска. После завершения пробега снимите прокладку чипа с держателя, откройте корпус чипа под углом 45 градусов и перенесите 100 микролитров эмульсии из чипа в скважину в синей пластиковой пластине 65 скважин.
Выпределите 125 микролитров розовой эмульсии, разбивая реагент на каждую эмульсию. Подождите одну минуту, а затем перенесите весь объем каждого хорошо в каждую 0,2-миллилитровую трубку. Убедитесь, что есть слой ясно и слой розового в трубе полосы.
С помощью пипетки снимите 125 микролитров розового слоя со дна трубчатой полосы, не нарушая четкого слоя. Это нормально для небольшого объема приблизительно 15 микролитров розового слоя, чтобы остаться в трубке. Затем добавьте 200 микролитров очистки смеси к каждой из полос трубки и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.
Перенесите полоски трубки на магнитный стенд и подождите две минуты, чтобы раствор был очищен. Удалите супернатант и отбросьте. Затем мыть бисер с 80%этанола в два раза.
Дайте бисеру высохнуть в течение одной минуты. Снимите полоски трубки с магнита и добавьте в бисер 35,5 микролитров раствора элюции. Пипетку повторно приостановить бисер в растворе и инкубировать в течение двух минут при комнатной температуре.
Перенесите полоски трубки на магнитную подсвечку и дайте раствору очиститься. Перенесите очищенную комплементарную ДНК из трубчатых полос на чистые 0,2-миллилитровые полосы трубки. Чтобы усилить комплементарную ДНК, сначала добавьте 65 микролитров дополнительной смеси мастера усиления ДНК к каждому образцу.
Поместите полоски трубки в термоциклер и запустите программу в соответствии с рукописью. Образцы могут храниться при четырех градусах Цельсия до 72 часов. После нормализации комплементарной ДНК до 15 анаграмм и 20 микролитров, aliquot 30 микролитров смеси тегментации к каждому дополнительному образцу ДНК на льду.
Положите образцы в термоциклер и запустите протокол тегов при 55 градусах по Цельсию в течение пяти минут, уменьшаясь до 10 градусов по Цельсию и удерживайте. Затем добавьте 60 микролитров индекса выборки PCR Master Mix и 10 микролитров 20-микромолейного индекса образца forolegol к 30-микролитру очищенного дополнительного образца ДНК. Верните трубки в термоциклер, чтобы усилить конечный библиотечный продукт.
Нормализует каждый образец с водой до двух нанограмм на микролитр и потяните три микролитера каждого нормализованного образца вместе в 1,5-миллилитровую трубку. Разбавить пул буфером элюциона до 0,25 нанограмма на микролитер. Денатурации бассейна путем объединения 12 микролитров разбавленного образца бассейна, один микролитер одного животного или ДНК-контроля, два микролитера буфера элюции, и пять микролитров 0,4 нормального гидроксида натрия.
Инкубировать смесь в течение пяти минут, затем добавить 10 микролитров 200-миллимолярной трис при pH8, и загрузить 4,05 микролитров смеси в 1345,95 микролитров HTA-1. Затем загрузите 1,3 миллилитров в картридж секвенсора и запустите в соответствии с руководящими принципами производителя, используя рецепт секвенирования. На компьютере запустите Cell Ranger, чтобы де-мультиплекс необработанных базовых файлов вызова, генерируемых секвенированием в файлах FAST.
Согласуем файлы FAST к сборке генома человека b37.3 и используйте модель гена CSC для получения количественной оценки экспрессии. Изучите участок ранга штрих-кода, чтобы убедиться в разделении связанных с ячейкой штрих-кодов и фона. Чтобы контролировать качество клеток, исключите клетки с менее чем 500 обнаруженными генами, менее 3000 общее количество уникальных молекулярных идентификаторов и более 0,2 балла жизнеспособности.
Отрегулируйте отрубы в зависимости от типов тканей и клеток. Далее, используйте R пакет mclust для удаления клеток, которые выражают более одного гена гормона. Используйте R пакет seurat для нормализации экспрессии генов на общий уникальный молекулярный идентификатор и размножаться в масштабе фактор 10000 на клеточном уровне.
Затем обнаружить переменные гены, используя среднюю экспрессию и дисперсию всех клеток. Отрегулируйте отрезание в зависимости от типов тканей и клеток. Выполните анализ основных компонентов с переменными генами.
Кластерные ячейки с выбранным числом основных компонентов. Получить клеточного кластера обогащенных генов, сравнивая один клеточный кластер с остальными клетками. В этом протоколе секвенирования РНК одной клетки приобретенные человеческие островки были впервые разобщены, как это было подтверждено альфа- и бета-клетками при флуоресценции РНК и гибридизации С2.
Успешный пример эмульсии после раздела шаг показывает равномерно бледный, облачный раствор с минимальным перегородки масло отделено от геля шарики. В отличие от этого, низкое качество эмульсии с четкой фазы разделения между гелем бисера и масла может быть связано с засорить во время запуска чипа. После дополнительного усиления ДНК, репрезентативное распределение размером с фрагмент показывает типичный пик для хорошего качества дополнительного образца ДНК, проживающего около 1000-2000 базовых пар.
Пик около 600 базовых пар был специфичен для островок-комплементарной ДНК. Распределение фрагментов по секвенированию РНК составило от 300 до 500 базовых пар. Анализ кластеризации выявил 12 типов клеток в пространстве T-распределенных размеров встраивания стохастического соседа.
Выявлены три под популяции в альфа-клетках и четыре в бета-клетках. Этот метод позволяет исследователям построить комплексные островки клеток для человеческих островков. С большим числом данных от не-диабетических и диабетических доноров, он используется для ресурса для терапевтического целевого открытия.
